基于YaxAB生物纳米孔的单分子蛋白质-药物相互作用指纹识别技术研究报告
一、 研究团队与发表信息 本研究由韩国生物科学与生物技术研究所（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB）疾病靶标结构研究中心、关键疾病诊断融合研究中心，以及成均馆大学（Sungkyunkwan University）物理学系、基础科学研究院（Institute for Basic Science, IBS）、韩国科学技术院（Korea Advanced Institute of Science and Technology, KAIST）等多个机构的科研人员共同完成。主要作者包括Ki-Baek Jeong, Minju Ryu, Jin-Sik Kim等。该研究成果于2023年发表在《自然·通讯》（*Nature Communications*）期刊上。
二、 研究背景与目标 本研究属于生物传感技术与药物发现交叉领域。当前，药物开发过程面临成本高昂、效率低下的严峻挑战。药物发挥疗效的核心在于与靶标蛋白（主要是蛋白质）发生物理相互作用。因此，在体外监测蛋白质-药物相互作用（Protein-Drug Interactions, PDIs）对于药物筛选、构效关系（Structure-Activity-Relationship, SAR）和作用机制（Mode-of-Action, MOA）研究至关重要。尽管已有多种生物物理方法，如核磁共振（NMR）、表面等离子体共振（SPR）、等温滴定量热法（ITC）和荧光技术等，可用于直接监测PDIs，但高效的药物筛选仍受到诸多严重限制，包括仪器成本高、标记或固定化导致的测量误差、对小分子药物检测灵敏度低、以及靶标蛋白和/或药物溶解度有限等。因此，亟需技术创新以克服现有局限，加速制药行业的药物发现进程。
纳米孔传感是一种新兴的单分子生物分子分析技术。其原理是在施加于纳米级孔道两端的电压下，分析物被电驱动通过孔道，引起特征性的离子电流阻断信号。该技术具备单分子分辨率、超灵敏、免标记、实时检测和高通量分析等潜力。由通道蛋白构成的生物纳米孔传感器具有孔径均一、低噪声、高分辨率且易于通过蛋白质工程进行修饰等优点。尽管蛋白质的折叠结构和非均匀电荷分布使其纳米孔分析较为复杂，但近期研究已开始尝试将生物纳米孔应用于折叠蛋白质的单分子分析。然而，现有的纳米孔传感器（如ClyA、PLYAB、MspA及固态纳米孔）主要基于配体诱导的蛋白质发生大的构象变化来进行分析。蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）是极具潜力的药物靶点，但针对PPIs的药物开发是重大挑战。在人类相互作用组中，已报道超过64.5万个与疾病相关的PPIs，但仅有约2%被用于药物开发。因此，市场对针对PPIs的低成本、高效药物筛选技术存在巨大需求。
本研究旨在开发一种新型生物纳米孔传感器，用于实现蛋白质及其与小分子药物相互作用的免标记、单分子检测。研究团队选择并利用来自肠道致病菌*Yersinia enterocolitica*的孔形成毒素YaxAB构建纳米孔。以抗癌靶标蛋白Bcl-xL及其与Bak-BH3肽以及小分子抑制剂（如ABT-737和A-1331852）的相互作用为模型体系，系统评估了YaxAB纳米孔在单分子水平上检测PDIs的能力，并探索了其在药物发现中的应用潜力。
三、 详细研究流程 本研究包含多个相互关联的实验流程，具体如下：
流程一：YaxAB纳米孔的制备与表征 1. 研究对象与处理：研究团队表达并纯化了*Yersinia enterocolitica*的YaxA和YaxB蛋白，通过体外组装和纯化，获得了三种不同寡聚体状态的YaxAB孔复合物：YaxAB-C8（16聚体）、-C9（18聚体）和-C10（20聚体）。通过非变性凝胶电泳和凝胶提取进行分离纯化。 2. 实验方法： * 结构表征：利用负染色电子显微镜（Negative-stain EM）观察了不同寡聚体形态，并通过三维重建确认了YaxAB-C8具有C8对称性。通过冷冻电镜结构分析，揭示了YaxAB-C8纳米孔呈长约18纳米的漏斗状结构，其入口（cis端）直径约10纳米，出口（trans端）直径约2.7纳米，最窄收缩区直径约1.9纳米。孔道内壁由8个凸起的α螺旋构成，呈“肋骨”状，表面带有显著负电荷。 * 电生理表征：在平面脂双层膜中插入单个YaxAB纳米孔，测量其单通道电导。YaxAB-C8、-C9、-C10在100 mV电压下的单位电导分别为5.0 ± 0.1 nS、7.8 ± 0.2 nS和10.9 ± 0.2 nS。通过电流-电压（I-V）曲线测量，发现所有孔型均表现出不对称性。 * 离子选择性分析：在不对称KCl浓度条件下测量反转电位，并使用Goldman-Hodgkin-Katz方程计算离子选择性。YaxAB-C8表现出强的阳离子选择性（P_K+/P_Cl- = 2.34 ± 0.03），这主要归因于收缩区聚集的负电荷。 * 分子动力学模拟：对YaxAB-C8纳米孔进行了分子动力学模拟，以研究其纳米流体特性。模拟显示，在正电压下，孔道内存在从cis端指向trans端的强电渗流，且K+离子和水的通量在收缩区域附近显著增加。
流程二：YaxAB纳米孔对未标记折叠蛋白质的单分子分析 1. 研究对象：选择了四种不同电荷和尺寸的蛋白质作为分析物：全铁转运蛋白（Holo-transferrin， 77.1 kDa， 净电荷 -2.9e）、Bcl-xL（20.8 kDa， 净电荷 -11.5e）、FKBP12（12.3 kDa， 净电荷 +2.8e）和MDM2（13.0 kDa， 净电荷 +0.6e）。通过圆二色光谱验证了这些蛋白质在纳米孔测量缓冲液中保持折叠状态。 2. 实验方法：将蛋白质样品添加到脂双层膜的cis侧，施加正电压。利用YaxAB纳米孔的强阳离子选择性产生的电渗流，成功捕获了所有这些折叠蛋白质，无论其净电荷如何。记录并分析了蛋白质被捕获时产生的离子电流阻断事件。 3. 数据分析与模型构建：对捕获的Bcl-xL分子产生的电流信号进行分析，发现其特征性的多级电流阻断（L1-L3水平）。结合分子动力学模拟计算的自由能景观，提出了一个三阶段的分子模型来解释单个纳米孔事件：捕获、阱内振荡和逃逸。模拟显示，被捕获的Bcl-xL分子在孔道内存在两个自由能最小值位置（距离膜约4 nm和10 nm），其在这两个位置间的振荡运动导致了观察到的多级电流信号。通过使用不同净电荷的Bcl-xL突变体进行实验，证实了电渗流和电泳力之间的平衡控制了蛋白质在孔道内的运动，从而产生不同的电流水平。
流程三：基于电流阻断分析蛋白质-配体相互作用 1. 研究对象：以Bcl-xL与Bak-BH3肽以及小分子药物ABT-737的相互作用为模型。 2. 实验方法：分别将游离的Bcl-xL、预孵育的Bcl-xL/Bak-BH3复合物和Bcl-xL/ABT-737复合物加入cis室，记录并分析其纳米孔事件。 3. 结果分析：游离Bcl-xL产生三个明显的电流阻断水平（L1-L3）。而与Bak-BH3肽结合后，主要诱导两个电流水平（L1和L2），L3水平几乎消失。与ABT-737结合后，也主要检测到L1和L2水平，且L1事件频率略有增加。这些电流分布模式的显著差异表明，YaxAB纳米孔可以灵敏地检测Bcl-xL与不同配体的结合。通过滴定实验，进一步证明了该方法可用于监测小分子药物（ABT-737）对PPI（Bcl-xL/Bak-BH3）的抑制作用。
流程四：基于电流噪声分析蛋白质-配体相互作用 1. 研究方法：除了电流阻断幅度，本研究还创新性地引入了电流噪声分析作为另一个维度的传感指标。通过分析纳米孔事件信号的功率谱密度，计算了电流噪声值。 2. 结果分析：在特定的低通滤波条件下（如100 Hz），游离Bcl-xL、Bcl-xL/Bak-BH3复合物和Bcl-xL/ABT-737复合物表现出显著不同的电流噪声水平。这种噪声差异可能源于分析物在孔道内的取向和偶极矩强度的可检测差异。研究进一步进行了基于噪声的剂量依赖性定量分析，测定了Bcl-xL与Bak-BH3肽、ABT-737和A-1331852的结合亲和力，其Kd值分别为66 ± 10 nM、38 ± 8 nM和19 ± 4 nM。这些结果与传统的SPR等方法测得的趋势一致，但数值存在差异，体现了单分子纳米孔传感与基于群体平均的 ensemble 实验之间的内在区别。
流程五：单分子PDI指纹识别与药物筛选应用验证 1. 区分结合剂与非结合剂：在Bcl-xL存在下，分别加入非结合小分子（LCL-161, GDC-0152等）和强结合剂（ABT-737, A-1331852）。结果显示，非结合剂/Bcl-xL混合物的电流信号与游离Bcl-xL重叠，而强结合剂/Bcl-xL复合物则产生了明显不同的电流阻断和噪声特征。将归一化电流阻断与电流噪声数据结合，绘制二维密度图，可以清晰地将不同小分子药物与Bcl-xL形成的复合物区分为独立的“指纹”峰，从而实现“基于纳米孔的药物指纹识别”。 2. 实时竞争结合监测：将Bcl-xL与包含非结合剂和强结合剂的化合物混合物同时孵育，进行实时电流记录。随着时间的推移，游离Bcl-xL的事件群逐渐减少，而Bcl-xL/强结合剂复合物的事件群逐渐出现并最终占据主导，且能区分出ABT-737和A-1331852两种不同结合剂的事件群。此外，在预形成的Bcl-xL/Bak-BH3或Bcl-xL/ABT-737复合物中滴定竞争性药物，可以实时观察到事件群从一种复合物向另一种复合物的动态转变，证明了该方法可用于研究药物竞争结合和结合位点映射。 3. 方法普适性验证：将YaxAB纳米孔传感应用于其他靶标蛋白，如FKBP12与其配体FK506、全铁转运蛋白与其小分子配体奥沙利铂的相互作用检测，均观察到了药物结合引起的电流模式特征性变化，证明了该技术对不同靶标蛋白的适用性。研究还测试了该方法在0-5% DMSO（常用于溶解难溶性小分子化合物）条件下的兼容性。
四、 主要研究结果 1. 成功开发了基于YaxAB毒素的新型生物纳米孔传感器：研究证实了YaxAB能够形成稳定、均一的纳米孔，其独特的漏斗状长通道结构、内壁“肋骨”状凸起以及强阳离子选择性产生的电渗流，使其能够高效捕获多种不同尺寸和电荷的折叠蛋白质（12-77 kDa），并产生高分辨率的电流信号。 2. 实现了对未标记折叠蛋白质的单分子检测与区分：YaxAB纳米孔能够捕获并区分不同蛋白质，其电流信号特征（多级阻断、噪声）与蛋白质在孔道内的动态振荡行为相关，该行为受电渗流和电泳力平衡调控，并受蛋白质净电荷和施加电压影响。 3. 建立了基于电流阻断和电流噪声的双重分析策略：该策略能够灵敏检测蛋白质与小分子药物或肽配体的结合。即使配体结合未引起蛋白质显著的构象变化，也能通过电流噪声的差异进行区分。这是本研究的一个关键创新点。 4. 实现了单分子水平的“药物指纹识别”：通过结合δI/I0和In两个参数，在二维图上可以将与同一靶蛋白结合的不同小分子药物清晰区分开来，形成独特的“指纹”。这为高通量药物筛选提供了前所未有的单分子分辨率。 5. 展示了在药物发现中的实际应用潜力：研究成功演示了该方法可用于：a) 区分靶蛋白的结合剂与非结合剂；b) 实时监测竞争性结合动力学；c) 定量测定结合亲和力；d) 适用于多个不同靶标蛋白体系；e) 在一定浓度范围内与药物溶解常用溶剂DMSO兼容。
五、 研究结论与意义 本研究成功开发并验证了一种基于YaxAB生物纳米孔的单分子传感平台，用于免标记、超灵敏地检测蛋白质-药物相互作用。该技术的核心价值在于其单分子检测能力，这带来了以下显著优势： * 超高灵敏度：仅需皮摩尔级别的样品量，有利于分析溶解度差的化合物和蛋白质。 * 免标记：无需对蛋白质或药物进行荧光标记等修饰，避免了标记可能带来的干扰和额外成本。 * 实时动态分析：能够监测瞬态或弱亲和力的相互作用，这是群体平均实验难以捕捉的。 * 高信息维度：通过同时分析电流阻断和噪声，提供了丰富的分子动态信息。 * 潜在低成本与高通量：相较于NMR、SPR等需要昂贵仪器的方法，纳米孔技术硬件成本相对较低，且未来易于与自动化、多通道系统集成以实现高通量筛选。
本研究将YaxAB纳米孔的应用从单纯的蛋白质检测拓展到了蛋白质-配体相互作用的精细分析领域，特别是能够区分结合了不同小分子药物的同一蛋白质复合物，这为药物发现，尤其是针对传统上“不可成药”的蛋白质-蛋白质相互作用靶点的药物筛选，提供了一种强大的新工具。该方法有望应用于先导化合物优化中的构效关系分析、作用机制研究以及片段库筛选等环节。
六、 研究亮点 1. 纳米孔传感机制的创新应用：首次将YaxAB这一漏斗状生物纳米孔用于PDI研究，并深入阐释了其利用电渗流捕获蛋白质、通过分析蛋白质在孔道内振荡运动产生的多级电流信号和噪声来探测配体结合的物理机制。 2. 多维信号分析策略：创造性地将传统的电流阻断幅度分析与电流噪声分析相结合，形成了高分辨率的二维“指纹”识别能力，极大地提高了区分相似复合物的精度。 3. 单分子PDI指纹识别的概念证明：首次在单分子水平上实现了对不同小分子药物与同一靶蛋白复合物的清晰区分和“指纹化”，为超灵敏药物筛选奠定了方法论基础。 4. 广泛的适用性验证：不仅在模型体系Bcl-xL上进行了深入表征，还成功在FKBP12和全铁转运蛋白等其他靶标上验证了方法的普适性，展示了其作为通用PDI分析平台的潜力。
七、 其他有价值的内容 研究还探讨了YaxAB纳米孔传感能力的结构基础：其长漏斗状几何形状增强了电流阻断信号对蛋白质位置的敏感性；内壁的“肋骨”状结构可能允许在蛋白质堵塞时仍有部分离子流通过，从而产生特征性的残余电流，有利于分析；强大的电渗流使其能够捕获带不同电荷的蛋白质。这些见解为未来设计性能更优的生物纳米孔传感器提供了指导。同时，作者也客观指出了当前技术的局限性，例如对分子量过大（> ~77 kDa）的蛋白质捕获能力有限，以及在较高浓度去垢剂条件下孔稳定性有待提高等问题，并展望了通过与更稳定的聚合物膜结合以及发展自动化高通量传感技术来推动其实际应用的前景。