循环血液中存在具有呼吸能力的完整游离线粒体

主要作者与机构

本研究由来自法国蒙彼利埃癌症研究所（IRCM, INSERM U1194, Université de Montpellier, Institut Régional du Cancer de Montpellier）的 Zahra Al Amir Dache、Alain R. Thierry 等研究者完成，合作单位包括 Gustave Roussy 癌症中心（INSERM U1030）和巴黎狄德罗大学雅克·莫诺研究所。通讯作者为 Alain R. Thierry。该研究于 2020 年发表于 The FASEB Journal 第 34 卷第 3616–3630 页，文章标题为 “Blood contains circulating cell-free respiratory competent mitochondria”。

研究背景

线粒体（mitochondria）是真核细胞内负责能量代谢和细胞信号传导的关键细胞器，其起源可追溯至远古原核生物与早期真核细胞的共生事件。线粒体保留了部分细菌祖先的特征，包括约 16 kb 的环状基因组（mitochondrial DNA, mtDNA）、双膜结构以及独特的蛋白质组。此前已有研究在细胞外空间检测到线粒体组分，包括线粒体 DNA 片段和被囊泡包裹的线粒体物质。循环线粒体游离 DNA（mitochondrial cell-free DNA, mcfDNA）作为一种潜在生物标志物在多种疾病诊断中显示出应用前景，但其在血液循环中的存在形式一直未被明确。与核来源的循环游离 DNA（nuclear cell-free DNA, ncfDNA）不同，线粒体 DNA 缺乏组蛋白保护，理论上更易被核酸酶降解。然而，此前研究者发现健康人血浆中线粒体基因组的拷贝数远高于核基因组，这暗示 mcfDNA 必然受到某种稳定结构的保护。基于上述背景，本研究旨在识别外周血中含线粒体 DNA 的结构，并进一步确定这些结构的生物学特性。

详细实验流程

本研究的实验工作分为多个递进的技术环节，研究对象包括来自健康志愿者的血液样本、50 例转移性结直肠癌（mCRC）患者的血液样本，以及多株培养细胞系（人结肠癌细胞系 DLD-1 和 SW620，以及正常永生化细胞系 CCD-18Co）。健康人血浆的分离采用了三种方案：Ficoll 密度梯度离心、常规离心（1200g）以及避免血小板激活的 CTAD 采血管联合梯度离心方案（PPAP）。细胞培养上清液在收集后先经 600g 低速离心去除细胞碎片，再根据实验需要进行后续处理。

在第一阶段，研究者通过定量 PCR（quantitative PCR, qPCR）测定了 99 名健康个体血浆中 ncfDNA 与 mcfDNA 的拷贝数，并计算 DNA 完整性指数（DNA integrity index, DII）。DII 的计算方式是长扩增子浓度与短扩增子浓度的比值，长扩增子长约 300 bp，短扩增子长约 60–100 bp。为精细分析 cfDNA 片段大小分布，研究者对 80 名健康个体的血浆 cfDNA 混合样品进行琼脂糖凝胶电泳，将大于和小于 500 bp 的片段分别切胶回收并做 qPCR 定量。此外，研究使用单链 DNA 文库构建方法与 Illumina MiSeq 平台进行了全基因组测序（whole genome sequencing, WGS），以获得核苷酸级别的片段长度信息。与此同时，研究者对 SW620 和 DLD-1 细胞培养上清中的 cfDNA 进行了长达 4 天的动力学稳定性实验，每日取样定量 mcfDNA 和 ncfDNA 以比较二者的降解速度。

在第二阶段，研究者通过差速离心和过滤实验来分离并富集含 mcfDNA 的结构。血浆和细胞培养上清分别经过 16000g 高速离心获得沉淀（16gp），同时将样品过 0.22 µm 滤膜以判断含 mcfDNA 结构的大小。DNA 提取采用 Qiagen 血液试剂盒，qPCR 使用针对线粒体 MT-CO3 基因和核 KRAS 基因的特异性引物。为验证 16gp 中 mcfDNA 的基因组完整性，研究者使用 REPLI-g 线粒体 DNA 扩增试剂盒对 16gp 的 DNA 进行全基因组扩增，然后用五对重叠引物（mito1、mito2、mito3、hmt1、hmt2）进行了长片段 PCR（long-range PCR, LR-PCR），扩增产物覆盖整个线粒体基因组。

在第三阶段，研究者通过多种独立的实验方法验证 16gp 中完整线粒体的存在。他们使用 MitoTracker Green FM（一种特异性标记线粒体膜的荧光探针）对血浆和细胞培养上清的 16gp 进行染色，随后通过荧光显微镜和流式细胞术（flow cytometry）进行检测。阳性对照为从培养细胞中分离的纯化线粒体，阴性对照为分离的细胞核和新鲜培养基的 16gp。研究者还通过免疫印迹（Western blot）检测了线粒体外膜转位酶 22（TOM22）和内膜转位酶 23（TIM23）蛋白在 16gp 中的表达情况。为了从形态学上确证线粒体的存在，研究者将血浆和细胞培养上清的 16gp 用戊二醛固定，经锇酸后固定、梯度乙醇脱水和树脂包埋后，制备 70 nm 超薄切片，用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）在 200 kV 下观察。

在最后一个实验阶段，研究者使用 Seahorse XF96 细胞外通量分析仪通过氧消耗率（oxygen consumption rate, OCR）来评估细胞外线粒体的呼吸功能。该电子流实验（electron flow assay）以新鲜分离的 DLD-1 细胞线粒体为阳性对照，将 64 µg 经 8000g 离心所得的血浆沉淀和细胞培养上清沉淀分别铺板。实验中加入丙酮酸和苹果酸驱动复合体 I 的呼吸作用，随后依次注射复合体 I 抑制剂鱼藤酮（rotenone）、复合体 II 激活剂琥珀酸（succinate）、复合体 III 抑制剂抗霉素 A（antimycin A），最后加入抗坏血酸与 TMPD 以刺激复合体 IV 的活性。整个测序数据分析中，短读序列通过 BWA aln 比对至人类参考基因组 hg19，重复序列用 Picard 工具去除，插入片段大小分布由 CollectInsertSizeMetrics 生成。

主要研究结果

在第一阶段，研究者发现健康人血浆中 mcfDNA 的拷贝数显著高于 ncfDNA。值得注意的是，mcfDNA 的完整性指数接近 1，表明几乎所有被检测到的线粒体 DNA 片段长度都在 300 bp 以上，而 ncfDNA 的完整性指数显著较低。琼脂糖凝胶电泳数据显示，仅约 10% 的 mcfDNA 质量来源于小于 500 bp 的片段。然而，全基因组测序结果显示，在 30–300 bp 范围内存在一个丰度递减的 mcfDNA 短片段群体，而大于约 1000 bp 的片段则无法被标准双端测序检测到。综合 qPCR 与测序数据，研究者推断 mcfDNA 至少包含两个群体：一个是由 30–300 bp 高度降解片段组成的次要群体，另一个是由长度超过 1000 bp 且占比超过 90% 的主要群体。细胞培养上清的动力学实验表明，无论来自 SW620 还是 DLD-1 细胞，长达 296–305 bp 的 mcfDNA 在 4 天内的稳定性均优于同等长度的 ncfDNA。

在第二阶段，差速离心实验显示，血浆和细胞培养上清经过 16000g 离心后，大量 mcfDNA 出现在沉淀中，而 ncfDNA 则几乎全部保留在上清液中。过滤实验进一步表明，ncfDNA 能够通过 0.22 µm 滤膜，但绝大多数 mcfDNA 不能通过，说明含 mcfDNA 的结构直径大于 0.22 µm。定量结果显示，细胞培养上清中 73% ± 11% 的 mcfDNA 和血浆中 78% ± 15% 的 mcfDNA 经 16000g 离心后富集于沉淀。DNase I 处理实验表明 16gp 中的 mcfDNA 受到完整膜结构的保护而未被降解。在仅使用 CTAD 抗凝并排除血小板激活的 PPAP 血浆中，上述结果仍然成立，说明线粒体并非因血小板在处理过程中被激活而释放。在 LR-PCR 实验中，来自 SW620 和 DLD-1 细胞培养上清 16gp 以及两个健康人血浆池 16gp 的样品均成功扩增出预期大小的五个线粒体基因组片段，而阴性对照中无任何扩增信号，证明这些结构中存在完整或接近完整的全长线粒体基因组。

在第三阶段，MitoTracker Green 染色结合流式细胞术和荧光显微镜在血浆 16gp 和细胞培养上清 16gp 中均检测到阳性信号，其荧光强度与纯化线粒体阳性对照相似，而细胞核和新鲜培养基阴性对照则无阳性信号。Western blot 实验在血浆 16gp 和所有三株细胞系培养上清 16gp 中检测到 TOM22 和 TIM23 蛋白的表达，进一步证明这些结构具有线粒体外膜和内膜的蛋白组成特征。透射电子显微镜观察证实，血浆 16gp 和细胞培养上清 16gp 中存在具有双层膜结构的颗粒，其直径约 0.4–1.5 µm，内部可见嵴样结构，形态与线粒体一致，尽管部分结构表现出一定程度的结构改变。

在功能验证阶段，Seahorse 电子流实验显示，DLD-1 细胞培养上清沉淀和健康人血浆沉淀均表现出可检测的基础氧消耗率。加入鱼藤酮后 OCR 明显下降，证实复合体 I 被有效抑制；随后加入琥珀酸引起 OCR 轻微上升，提示复合体 II 可能部分保留功能；加入抗霉素 A 后 OCR 进一步下降，而加入抗坏血酸与 TMPD 后 OCR 重新上升，说明复合体 IV 在这些细胞外线粒体中具有活性。这些结果表明血浆和细胞培养上清中至少存在一部分具有呼吸能力的完整线粒体，而非仅仅是被动释放的膜碎片。

研究结论、意义与亮点

本研究首次证明，在正常生理状态下的人类外周血中存在完整的、具有呼吸能力的细胞外游离线粒体。与此同时，培养肿瘤细胞和正常细胞均能向胞外释放线粒体，表明这一现象并非血液系统特有，也不依赖于血小板激活。研究估算每毫升血浆中约含有 20 万至 370 万个完整游离线粒体。这一发现突破了此前线粒体仅作为细胞内能量工厂的传统认知，将其角色拓展为循环系统中的多功能信号载体。

本研究的科学价值体现在多个方面：首先，它解决了 mcfDNA 在循环中高稳定性与缺乏组蛋白保护之间的矛盾，证明全长线粒体基因组被完整的线粒体膜结构所包被；其次，它揭示了 mcfDNA 的异质性结构基础，为理解 mcfDNA 片段化机制提供了新的框架；第三，完整呼吸型游离线粒体的发现为细胞间通讯的研究开辟了新的方向，尤其是线粒体在炎症、免疫反应和组织损伤修复中的潜在信使功能。在应用层面，循环游离线粒体有潜力成为疾病早期诊断和预后评估的新标志物，其蛋白质组和基因组分析可能比单独检测 mcfDNA 提供更丰富的病理信息。此外，线粒体移植治疗正成为再生医学的前沿领域，本研究为寻找天然线粒体转移机制提供了关键线索，未来可能通过解析循环线粒体的来源与去向，设计新的治疗策略。