主要作者与发表信息
本研究由乌普萨拉大学（Uppsala University）材料科学与工程系、生命科学实验室（Science for Life Laboratory）的Federico Cantoni、Laurent Barbe、Hannah Pohlit以及Maria Tenje（通讯作者）共同完成。该研究成果于2024年1月4日在线发表于*Advanced Materials Technologies*期刊，论文标题为“A Perfusable Multi-Hydrogel Vasculature On-Chip Engineered by 2-Photon 3D Printing and Scaffold Molding to Improve Microfabrication Fidelity in Hydrogels”。
学术背景与研究目的
在药物开发和医学研究中，体外（in vitro）细胞模型是重要的研究工具。然而，传统的二维细胞培养无法模拟生理微环境，可能改变细胞行为并影响实验结果。相比之下，微生理系统（Microphysiological Systems, MPS）或器官芯片（Organs-on-chips）能够更精确地控制细胞微环境，提供更具仿生性的培养条件。构建三维细胞模型的关键在于模拟天然组织的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）的力学和化学特性。水凝胶（hydrogel）因其高含水量和聚合物网络结构，成为模拟人体生理环境的理想材料。然而，水凝胶在与细胞培养基平衡时会发生体积变化（溶胀，swelling），这会严重影响微结构打印的保真度。
在三维细胞培养中，构建血管网络以确保营养交换和废物清除是防止材料内部细胞坏死的关键。现有的方法，如利用生物学血管生成（angiogenesis）过程，虽然能模拟体内结构，但缺乏对血管密度和几何形状的控制。工程学方法，如牺牲结构铸造或粘性指进（viscous fingering），在空间位置控制精度和设计自由度方面存在局限。双光子聚合（Two-Photon Polymerization, 2PP）技术以其亚微米级的分辨率成为一种高保真三维打印手段，但该技术面临的挑战包括：用于细胞包埋（cell encapsulation）时，光引发剂产生的自由基对细胞具有毒性；长时间打印过程中细胞沉降影响打印质量；细胞对光的散射会降低交联密度，从而影响打印保真度。因此，本研究旨在开发一种新的细胞友好型制造策略，在生理相关性水凝胶中实现高保真度的可灌注多水凝胶血管网络模型，同时避免制造过程对细胞的损伤。
详细工作流程与实验方法
本研究提出了一种两步法制造策略。第一步，在微流控芯片内部，利用双光子聚合（2PP）技术，以明胶基生物墨水（U200, BIOINX）打印出血管网络骨架。该步骤中不含细胞，因此避免了光毒性对细胞的伤害以及细胞对打印保真度的干扰。第二步，在打印出的血管骨架周围，注射载有人肺成纤维细胞（Human Lung Fibroblasts, HLFs）的纤维蛋白（fibrin）水凝胶。最后，在打印的通道内部接种人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs），形成可灌注的血管化共培养系统。
打印参数优化与溶胀实验：为了最小化水凝胶溶胀，研究者首先对打印参数进行了筛选。他们以100 mW的恒定激光功率、0.5 μm的恒定扫描间距（hatching），测试了不同的扫描速度（200–1000 mm/s）和切片层距（1–9 μm）。打印完成后，将结构在细胞培养基中孵育24小时以达到平衡，随后通过共聚焦显微镜测量结构顶面面积并计算线性溶胀率。结果表明，9 μm层距和1000 mm/s速度会导致结构严重变形或无法保留；1 μm层距会导致局部能量过高，使交联剂失活，反而降低交联密度。最终确定600 mm/s的扫描速度和3 μm的切片层距为最优参数，能够使溶胀最小化。
生物相容性验证：研究者分别评估了2PP水凝胶对二维和三维培养的生物相容性。对于二维培养，他们在2PP打印的水凝胶圆盘表面培养HUVECs，以涂有促粘附溶液的玻璃表面作为对照。结果显示，两种条件下细胞在10天内均保持高活力（对照约95%，水凝胶上约85%），但水凝胶上的细胞增殖速度略有延迟。对于三维培养，研究者将HLFs包埋在2PP墨水中进行打印，并以载有HLFs的纤维蛋白水凝胶作为对照。结果显示，两种水凝胶中的成纤维细胞活力均约为90%，无显著差异。然而，细胞包埋严重影响了2PP打印质量，在细胞周围观察到水凝胶信号减弱，表明细胞引起了光散射和自由基终止，导致交联不均匀。这进一步证明了本研究所提出的“先打印、后包埋细胞”两步法的必要性。
多水凝胶结构制造与灌注验证：在制造多水凝胶结构时，2PP打印的通道壁厚为40 μm，连接器（connector）壁厚约为175 μm。研究者测试了不同浓度的纤维蛋白原（fibrinogen，2.5、5、10 mg/mL）与0.5 U/mL凝血酶（thrombin）混合的纤维蛋白前体溶液。结果发现，2.5 mg/mL的纤维蛋白水凝胶在去除未交联墨水并开始灌注后，在连接器和通道附近发生回缩；而5和10 mg/mL的纤维蛋白水凝胶表现出良好的粘附性。通过注入4 μm微珠验证了通道的可灌注性。综合考量细胞迁移和增殖能力，选择5 mg/mL纤维蛋白原作为最终浓度。此外，该策略还被验证可兼容纯胶原蛋白（collagen）及胶原蛋白/纤维蛋白混合水凝胶。
特征尺寸与扩散性能测试：为评估制造组织样特征尺寸的能力，研究者以40 μm恒定壁厚打印了内径为10、20、30、40和60 μm的通道。结果显示，所有内径的通道在10天培养后均未发生塌陷，但内径≥40 μm的通道在注射纤维蛋白水凝胶时因压力作用发生了一定程度的y轴压缩（偏心率在0.7至0.9之间）。内径小于10 μm的通道会发生堵塞。此外，利用荧光漂白后恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP）技术，研究了不同分子量FITC-葡聚糖（4、40、70、250、500 kDa）在2PP水凝胶中的扩散性。结果显示，分子量高达250 kDa的分子仍可在水凝胶中扩散，但500 kDa的分子无法扩散。这表明共培养中细胞产生的信号分子（通常小于250 kDa）可以在两种水凝胶之间传递，而纤维蛋白原和胶原蛋白前体（分子量约300–350 kDa）则不易穿透通道壁导致堵塞。
共培养与灌注实验：在验证了制造策略的可行性后，研究者进行了HUVECs和HLFs的共培养实验。在笔直通道和分支通道模型中，先在2PP骨架周围注射载有HLFs的纤维蛋白水凝胶（7.5 × 10⁵ cells/mL），然后将HUVECs（1.5 × 10⁷ cells/mL）接种到通道内部。通过定制的灌注系统，以间歇流（0.1 μL/min，3分钟/4小时，剪切应力约0.6 dyne/cm²）灌注细胞培养基，持续10天。结果显示，HUVECs在2–6天内形成均匀的内皮层，10天后形成汇合的单层。细胞核取向分析显示，通道内的HUVECs细胞核沿通道轴优先排列，而水凝胶圆盘和玻璃表面上的细胞则无此趋势。此外，在成纤维细胞存在的情况下，HUVECs形成穿透2PP通道壁的丝状伪足（filopodia）结构，表明细胞具有向周围水凝胶迁移和出芽的能力。研究者还设计了一种带有锥形侧孔（截锥形，小孔径10 μm朝外）的通道，以引导HUVECs向纤维蛋白基质定向迁移和出芽，实现了工程化与生物驱动相结合的血管生成模型。
主要结论与价值
本研究成功开发了一种新的两步法制造策略，结合双光子聚合（2PP）的高精度和水凝胶铸造的细胞相容性，在微流控芯片内构建了可灌注的多水凝胶血管网络模型。该策略能够在10天内支持HUVECs和HLFs的共培养，细胞活力保持在90%以上，并成功实现了小至10 μm的通道内径制造，复制了人体毛细血管的尺寸特征。该研究的科学价值在于提供了一种在不牺牲打印保真度的前提下实现细胞友好型高分辨率三维生物打印的解决方案，解决了细胞包埋对2PP打印质量的负面影响。其应用价值在于，该体系为构建血管化微生理系统提供了新的平台，能够支持多种水凝胶组合，并且所有制造、培养、染色和成像步骤均可在同一微流控芯片内完成，大大简化了操作流程。此外，通过在2PP通道上制造侧孔，研究者展示了引导HUVEC迁移和出芽的能力，为未来研究定向血管生成和血管出芽提供了可控的体外模型。
研究亮点
本研究的亮点主要包括：第一，提出了创新的两步法制造策略，将高分辨率2PP打印与细胞友好型水凝胶铸造相结合，有效规避了细胞毒性和打印保真度下降的问题。第二，该策略支持多水凝胶组合，为不同细胞类型提供各自适宜的微环境。第三，所有步骤均在微流控芯片内完成，实现了高度集成化和用户友好性。第四，成功制造了内径小至10 μm的可灌注通道，达到了模拟人体毛细血管的尺寸水平。第五，通过制造侧孔，实现了对HUVEC迁移和出芽的定向引导，为工程化血管生成研究提供了新工具。