本研究由Maik Wildhagen、Nina Malke、Qimin Wang、Xiaoying Zhuang及Sascha Beutel等人完成，主要作者来自莱布尼茨汉诺威大学技术化学研究所和光子学研究所。该论文发表于*Engineering in Life Sciences*期刊，2026年第26卷，文章编号e70069，于2025年8月9日投稿，2026年1月21日被接收。

橙皮素（hesperetin）是一种具有重要生物活性的黄酮类化合物，在制药、营养保健品和功能性食品领域具有广泛应用前景。其最为突出的特性之一是能够作为甜味受体的正向变构调节剂，在低至100 ppm的浓度下使蔗糖溶液的感知甜度提升高达41%，却不与受体活性位点直接结合。此外，橙皮素还具有神经保护作用和抑制胆固醇生物合成的功能。然而，橙皮素在柑橘皮中的天然含量极低，且传统溶剂萃取法受农业季节性影响大、环境足迹高，难以实现高纯度、低成本的可持续供应。柚皮素（naringenin）是一种廉价易得的前体化合物，理论上可通过两步酶催化反应转化为橙皮素：首先在3′位羟基化生成圣草酚（eriodictyol），再在4′位进行O-甲基化生成橙皮素。但在植物中，这两步反应分别依赖细胞色素P450单加氧酶和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖性甲基转移酶，前者在原核宿主中表达困难，后者则需要高效的辅因子再生策略支撑。本研究的目标即是在大肠杆菌（*Escherichia coli*）中构建一条P450非依赖性、辅因子自循环的全细胞生物转化路线，实现从柚皮素到橙皮素的高效生产。

研究首先分别验证了两个酶促步骤的可行性。第一步羟基化反应采用了来源于Rhodococcus opacus B-4的4-羟苯乙酸3-单加氧酶（HpaB）的Y215A突变体，以及来源于*Pseudomonas aeruginosa*的黄素氧化还原酶（HpaC），两者共同构成HpaBC复合物。将携带phpabc质粒的重组菌株E. coli_HpaBC在AM培养基中培养，诱导后1小时加入0.367 mM柚皮素。结果表明，在底物加入后的3.25小时内柚皮素被完全转化为圣草酚，最大转化率达到100%摩尔转化效率，且无副产物生成。然而，延长培养时间后圣草酚浓度出现下降，这归因于其B环上邻苯二酚结构易发生氧化降解。第二步甲基化反应则采用来源于薄荷（*Mentha x piperita*）的类黄酮4′-O-甲基转移酶（FOMT）和来源于拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）的卤代甲基转移酶（HMT）。HMT能够以S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）和甲基碘（MeI）为底物，一步再生SAM。体外实验显示，在仅加入0.1 mM SAM而无再生系统时，橙皮素产量仅为0.11 mM，与初始SAM浓度一致；而在加入HMT和MeI的再生体系中，橙皮素产量达到0.67 mM，对应的转化率约为93%，证明SAM被成功循环利用。体内实验中，共表达FOMT与HMT的菌株E. coli_FOMT-HMT实现了17.8%的圣草酚转化率。

随后，研究将两步反应整合到单一重组菌株中。构建了两个全细胞生物转化菌株：E. coli_WCB1共表达HpaBC、野生型FOMT和HMT；E. coli_WCB2则携带突变型FOMT S142V。初始摇瓶实验中，WCB1在3小时内实现了86%的柚皮素羟化转化，但最终橙皮素产量极低；WCB2虽然产生了较多副产物异樱花素（isosakuranetin，0.135 mM），但橙皮素产量达到0.076 mM，对应23%的产率。生物反应器培养条件下，两株菌的橙皮素产率均低于摇瓶水平，这可能与较高的氧传递速率促进了圣草酚氧化以及受控pH 7.5降低了甲基转移酶活性有关。

基于WCB2较高的产物产量，研究对其进行了系统的过程优化。通过延迟MeI添加时间的策略实现羟基化与甲基化的时间解耦，以减少底物柚皮素的过早甲基化。结果表明，延迟12小时添加MeI可获得最高的橙皮素滴度0.19 mM（55.7%产率），同时将副产物异樱花素限制在0.07 mM（23%）；而仅延迟3小时则导致异樱花素大量积累（0.16 mM）和橙皮素产率下降至32.7%。进一步采用全因子实验设计（DoE）优化诱导参数，发现预测的诱导OD600与实际最优值存在偏差：在OD600为1.6时诱导获得了61.7%的最高产率，而非模型预测的3.6。补充圣草酚的实验则获得了全研究最高产率——当额外添加0.017 mM圣草酚时，橙皮素产率达到70.6%（0.233 mM），副产物异樱花素仅为10.6%。此外，研究还应用了监督机器学习模型，包括随机森林（RF）和多层感知器（MLP）神经网络，基于约100个摇瓶实验数据预测最优过程条件。随机森林模型表现最佳，平均均方根误差为0.075，显著优于MLP（0.147）。尽管机器学习推荐的条件未能超越70.6%的最高产率，但成功识别了最小化副产物的参数组合，验证了数据驱动工具在过程开发中的实用价值。

本研究的主要结论是：通过将HpaBC羟化酶复合物、植物来源的FOMT甲基转移酶以及HMT介导的SAM再生系统整合到*E. coli*中，成功实现了从柚皮素到橙皮素的两步全细胞生物转化。经过延迟共底物添加、诱导条件优化和机器学习辅助参数选择，橙皮素产率达到70.6%，为目前报道的*E. coli*中最高产率。本研究的科学价值在于展示了P450非依赖性黄酮羟化与SAM再生甲基化的协同策略在微生物平台中的可行性，为甲基化黄酮类化合物的可持续生产提供了可扩展的蓝图。其应用价值体现在为功能性食品、饮料和营养保健品行业提供了一种天然成分的绿色制造替代方案，尤其适用于减糖配方和健康促进产品。研究的亮点包括：非天然HpaB同源物的高效利用、一步SAM再生模块的体内功能验证、延迟MeI添加这一简单而有效的过程策略，以及机器学习与实验验证相结合的优化方法论。未来工作将聚焦于基因表达平衡、关键酶蛋白质工程以及将预测模型扩展至生物反应器系统和物理信息神经网络等方向。