类型a：学术研究报告

作者及机构
本研究的通讯作者为Jialei Yang（北京天坛医院，首都医科大学，国家神经系统疾病临床医学研究中心），合作作者包括Shipo Wu（北京生物技术研究所先进生物技术实验室）和Miao He（北京天坛医院）。该研究于2025年7月31日发表在期刊《Redox Biology》（影响因子未明确，但属于氧化还原生物学领域的高水平期刊）。

学术背景
缺血性卒中（ischemic stroke）是全球范围内致死和致残的主要原因之一，但目前缺乏有效的神经保护治疗手段。近年来，铁死亡（ferroptosis，一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式，以脂质过氧化为特征）被证实是神经元损伤的关键驱动因素。然而，线粒体如何将缺血与铁死亡联系起来的具体机制尚不明确。

线粒体不仅是细胞能量代谢的核心，也是活性氧（reactive oxygen species, ROS）的主要来源。在缺血再灌注损伤中，线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）的异常开放会导致线粒体ROS（mtROS）大量释放，进而触发铁死亡。与此同时，近年研究发现线粒体可编码环状RNA（mitochondrial circRNA, mt-circRNA），这类RNA具有高度稳定性，可能在调控线粒体功能中发挥重要作用。然而，mt-circRNA是否参与调控神经元铁死亡仍未被探索。

本研究旨在：(1) 鉴定在脑缺血中发挥保护作用的mt-circRNA；(2) 解析其通过mPTP调控铁死亡的分子机制；(3) 开发一种靶向递送系统，以增强其神经保护作用。

研究流程
1. 缺血性卒中模型中铁死亡的验证
- 研究对象：C56BL/6雄性小鼠（8-9周龄），分为假手术组和大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型组。
- 实验方法：通过TTC染色确认脑梗死体积；检测铁死亡标志物（4-HNE、MDA、铁含量、GSH/GSSG比值）；免疫荧光染色观察神经元脂质过氧化（4-HNE/NeuN共定位）。
- 关键结果：tMCAO小鼠缺血半球4-HNE、MDA和铁水平显著升高，GSH降低，证实缺血再灌注诱导神经元铁死亡。

1. 氧糖剥夺（OGD）模型中线粒体ROS与铁死亡的关系

   • 研究对象：小鼠神经母细胞瘤Neuro2A（N2A）细胞，分为对照组和OGD组。
     
   • 实验方法：使用MitoSOX（线粒体ROS探针）、MitoPerDPP（线粒体脂质过氧化探针）和JC-1（线粒体膜电位探针）检测氧化应激；Calcein-CoCl₂淬灭实验评估mPTP开放。
     
   • 关键结果：OGD导致mtROS和mPTP开放增加，而mPTP抑制剂环孢素A（CsA）可逆转这一现象，表明mPTP是铁死亡的关键调控点。
     

2. 线粒体环状RNA circMTCO2的鉴定与功能研究

   • 发现阶段：通过circRNA测序从小鼠脑组织中鉴定出65种mt-circRNA，其中circMTCO2（源自线粒体基因mt-CO2）在缺血后表达显著下调。
     
   • 验证实验：RNase R和放线菌素D处理证实circMTCO2的环状结构和稳定性；qRT-PCR显示其在OGD和tMCAO模型中均下调。
     
   • 机制探索：RNA pull-down联合LC-MS/MS鉴定出circMTCO2与腺苷酸转运蛋白1（ANT1，mPTP的核心组分）直接结合；突变结合位点（36-120 nt区域）后，其抑制mPTP开放的作用消失。
     

3. 双靶向细胞外囊泡递送系统的开发

   • 设计：利用狂犬病毒糖蛋白（RVG）修饰的细胞外囊泡（EVs）实现神经元靶向，并加载线粒体靶向分子（TPP-PDL）以增强circMTCO2的线粒体定位。
     
   • 验证：透射电镜和动态光散射显示EVs粒径约115 nm；绝对定量qPCR证实每个EV携带约5拷贝circMTCO2；共聚焦显微镜显示RVG-EVMT-RNA可精准递送至神经元线粒体。
     

4. 体内外治疗效果评估

   • 体外：RVG-EVMT-RNA处理显著减少OGD诱导的mtROS、脂质过氧化和细胞死亡。
     
   • 体内：tMCAO小鼠静脉注射RVG-EVMT-RNA后，脑梗死体积减小，神经功能评分（mNSS、转棒实验等）改善，且无系统性毒性（H&E染色和血液生化指标正常）。
     

主要结果与逻辑关联
- 结果1：缺血通过mPTP开放和mtROS释放触发铁死亡，而circMTCO2表达下调削弱了内源性保护机制。
- 结果2：circMTCO2通过结合ANT1抑制mPTP开放，这一作用依赖其36-120 nt区域。
- 结果3：双靶向EVs成功将circMTCO2递送至神经元线粒体，逆转缺血导致的铁死亡和神经损伤。
- 逻辑链条：从机制解析（circMTCO2-ANT1-mPTP轴）到干预策略（EV递送），研究逐步验证了“恢复内源性circRNA可对抗铁死亡”的假说。

结论与价值
1. 科学价值：首次揭示mt-circRNA通过调控mPTP影响铁死亡，拓展了非编码RNA在细胞死亡领域的作用。
2. 应用价值：RVG-EVMT-RNA为缺血性卒中提供了器官-细胞器双靶向的治疗新策略，且安全性良好。
3. 观点创新：线粒体基因组编码的circRNA可作为“内置抗氧化系统”，未来或可应用于其他退行性疾病。

研究亮点
- 发现新颖性：circMTCO2是首个被证实通过ANT1调控mPTP的mt-circRNA。
- 技术突破：双靶向EV系统实现RNA的神经元-线粒体精准递送。
- 转化潜力：EVs的临床兼容性高，且circMTCO2具内源性安全性。

其他价值
研究提出了“线粒体circRNA疗法”的概念，为帕金森病、阿尔茨海默病等mtROS相关疾病提供了新思路。