关于“基于小檗碱的异质线性超分子通过自组装策略中和马兜铃酸急性肾毒性”研究的学术报告
一、 研究作者、机构与发表信息 本项研究由来自北京中医药大学中药学院和生命科学学院的科研团队共同完成。主要作者包括Penglong Wang、Wenbo Guo、Guangrui Huang、Jianhua Zhen（以上四位为共同第一作者）、Yini Li、Tong Li、Lu Zhao、Kai Yuan、Xuehao Tian、Xuemei Huang、Yanyan Feng，通讯作者为Haimin Lei（雷海民）教授和Anlong Xu（徐安龙）教授。该研究成果以题为“Berberine-Based Heterogeneous Linear Supramolecules Neutralized the Acute Nephrotoxicity of Aristolochic Acid by the Self-Assembly Strategy”的研究论文形式，于2021年7月11日在线发表于材料科学领域知名期刊《ACS Applied Materials & Interfaces》（2021年，第13卷，第32729-32742页）。
二、 学术背景与研究目的 本研究的科学领域交叉了天然药物化学、超分子化学、毒理学和系统生物学。其核心背景在于解决马兜铃酸（Aristolochic Acid, AA）这一传统中药中已知的有毒成分所带来的严重临床安全问题。AA已被证实可导致急性肾损伤（Acute Kidney Injury, AKI）、马兜铃酸肾病（Aristolochic Acid Nephropathy, AAN）乃至肝癌，这极大地限制了含AA药材的临床应用。然而，传统中医药实践中，含AA的药材常与含小檗碱（Berberine, Ber）的药材（如黄连）配伍使用，并显示出较高的安全性。这种“配伍减毒”的传统经验背后，其确切的化学与生物学机制尚不明确。
研究团队基于前期发现——Ber能与多种酸性植物化学物通过自组装形成具有增强抗菌活性的超分子，提出科学假设：Ber与AA之间也可能发生直接的自组装，所形成的超分子结构可能屏蔽AA的毒性基团，从而中和其毒性。因此，本研究旨在：1. 从化学上证实AA与Ber能否自组装形成新型超分子结构（命名为A-B）；2. 在体内外系统评估A-B超分子是否能有效降低AA的急性肾毒性；3. 从肠道菌群稳态和肾脏基因表达调控等多维度，深入揭示A-B超分子减毒的生物学机制。该研究不仅旨在阐明传统中药配伍减毒的现代科学内涵，也为利用自组装策略设计低毒高效的天然药物新剂型提供了新思路。
三、 详细研究流程与方法 本研究包含一个系统性的工作流程，从化学表征到体内外生物学验证，再到机制探索，共分为五个主要环节。
第一环节：A-B超分子的制备与化学表征。 研究采用一步自组装法合成A-B：将AA水溶液pH调至7.0-7.5后，与等摩尔量的Ber水溶液在80°C下搅拌反应1小时，离心后即得A-B组装体。 表征手段全面且深入： 1. 形貌与尺寸：采用场发射扫描电子显微镜（FESEM）和透射电子显微镜（TEM）观察，发现A-B形成宽度50-200纳米、长度数十微米的交叉网络状线性纤维结构。Zeta电位为-38.5 mV，表明其良好的胶体稳定性。 2. 组成与相互作用： * 紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）：A-B的谱图同时出现了AA和Ber的特征吸收峰，证明两者共存于组装体中。 * 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）：AA的羰基伸缩振动峰（1685 cm⁻¹）在A-B中移至1577 cm⁻¹，表明羧基的电子云密度降低，提示AA的羧基是参与相互作用的关键位点。 * X射线衍射（XRD）：AA和Ber单体均显示尖锐的晶体衍射峰，而A-B无对应特征峰，表明自组装后形成了无定形结构。 * 核磁共振氢谱（¹H NMR）与旋转坐标系奥氏效应谱（ROESY 2D NMR）：¹H NMR显示A-B中Ber的H-13、H-1以及AA的H-9、-OCH₂O-等质子信号发生明显高场位移，提示存在π-π堆积作用。ROESY 2D NMR进一步提供了空间邻近信息，明确了Ber的苯环（9-OCH₃, 10-OCH₃, H-11, H-12）与AA的苯环（H-5, H-6, H-7）相关，Ber的H-13与AA的H-2, H-5, H-9相关等，详细描绘了分子间紧密的π-π堆积模式。 * 高分辨质谱（HRMS）：检测到m/z 677.17639的离子峰，对应于AA/Ber = 1:1的组装单元，直接证明了基于酸碱静电相互作用的组装单元的存在。 * 等温滴定量热法（ITC）：滴定实验显示AA与Ber的结合是放热、自发的过程。结合常数（Ka）高达4.149 × 10⁶ M⁻¹，表明相互作用非常强。负的焓变（ΔH = -70.16 kJ·mol⁻¹）和负的熵变（ΔS）表明该组装是焓驱动的，涉及静电相互作用、氢键或π-π堆积等化学反应，且高度有序的组装过程降低了体系能量均匀性。 3. 释放特性：通过电导滴定和高效液相色谱（HPLC）分析，证实A-B在模拟消化环境中几乎不释放游离的AA和Ber，说明其结构稳定。
第二环节：体内毒性评估（小鼠模型）。 研究使用8周龄C57BL/6雄性小鼠（每组n=10），设置四组：对照组（CK，给予PBS）、AA组（10 mg/kg/天）、A-B组（19.8 mg/kg/天，与AA组AA摩尔量相同）、A&B机械混合物组（AA 10 mg/kg/天 + Ber 9.8 mg/kg/天）。连续灌胃3天。 评估指标包括： 1. 体重变化：监测小鼠体重。 2. 肾功能生化指标：第4天采集血清，检测血尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）和尿酸（UA）水平。 3. 肾脏组织病理学：取肾脏进行苏木精-伊红（H&E）染色和过碘酸雪夫（PAS）染色，在光学显微镜下观察组织病理变化。 4. 斑马鱼毒性验证：作为补充的体内生物安全性模型，使用1日龄斑马鱼幼鱼，在含有AA、A-B或A&B的Holtfreter’s溶液中孵育48小时，观察畸形和死亡情况，评估毒性。
第三环节：抗菌活性评估。 为验证自组装是否影响Ber固有的抗菌活性，研究选取了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）作为模型，通过体外实验评估了Ber、AA和A-B的最低抑菌浓度（MIC），以比较其抗菌效力。
第四环节：肠道菌群16S rDNA测序分析。 收集各组小鼠的粪便内容物，使用Illumina Hiseq平台进行全长16S rDNA测序。 分析内容包括： 1. α多样性：计算Shannon指数和Simpson指数。 2. β多样性：基于Bray-Curtis距离进行主坐标分析（PCoA）和相似性分析（Adonis）。 3. 菌群组成：在属水平上分析特定菌群（如Lachnospiraceae NK4A136 group、Anaerotruncus、Bacteroides、Parabacteroides）的相对丰度变化。 4. 功能预测：利用PICRUSt基于KEGG数据库预测菌群功能通路的变化。
第五环节：肾脏转录组学（RNA-Seq）与免疫学机制探索。 从每组随机选取3个小鼠肾脏样本，使用Illumina Novaseq平台进行RNA测序。 分析流程包括： 1. 差异表达基因（DEGs）鉴定：使用DESeq2软件，以“倍数变化≥2且FDR≤0.001”为阈值，筛选各组间的DEGs。 2. 功能富集分析：对DEGs进行KEGG通路富集分析，重点关注免疫系统和癌症相关通路。 3. 免疫细胞浸润分析：利用基因集变异分析（GSVA）和已知的免疫细胞标志基因集，评估肾脏中自然杀伤（NK）细胞、中性粒细胞等免疫细胞的浸润情况。 4. 关键蛋白验证：通过免疫组织化学染色和蛋白质印迹法（Western Blot），在蛋白水平上验证核因子κB p65（NF-κB p65）、磷酸化p65（p-p65）、丝裂原活化蛋白激酶p38（MAPK p38）、磷酸化p38（p-p38）以及肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）等关键炎症因子的表达变化。
四、 主要研究结果及其逻辑关联 1. 化学表征结果：成功证实AA与Ber通过静电吸引（AA的羧基与Ber的季铵盐离子）、π-π堆积和疏水作用，自发组装成稳定的、线性的、异质超分子（A-B）。该组装体具有“亲水内核、疏水外壳”的反转结构，其强大的结合常数和紧密的堆积模式，从理论上为“屏蔽AA毒性位点”提供了化学基础。释放实验证明A-B在消化环境中稳定，暗示其可能以完整组装体形式被处理，减少了游离AA的暴露。
2. 体内毒性评估结果： * 小鼠实验：AA组和A&B机械混合物组小鼠体重显著下降，血清BUN、Cre、UA水平异常升高，肾脏组织出现明显的肾小管上皮细胞变性坏死、管腔扩张、炎性细胞浸润等急性肾损伤病理改变。关键发现是：A-B组小鼠的体重变化、肾功能指标和肾脏病理形态均与对照组（CK）相似，未出现明显毒性迹象。这表明，只有通过自组装形成的A-B超分子才能有效中和AA毒性，而简单的机械混合（A&B）无效，突出了“自组装”这一特定结构的必要性。 * 斑马鱼实验：与小鼠结果一致，AA和A&B处理导致高比例斑马鱼出现畸形或死亡，而A-B组则几乎无毒性表现，进一步在另一模型上验证了A-B的减毒效果。
3. 抗菌活性结果：A-B超分子保持了与Ber单体相似的抗MRSA活性，表明自组装策略在降低AA毒性的同时，并未削弱Ber原有的有益药理作用（抗菌），实现了“减毒而不减效”。
4. 肠道菌群结果：AA处理破坏了肠道菌群稳态，表现为α多样性指数改变、β多样性显著区分，并特异性下调了Lachnospiraceae NK4A136 group和Anaerotruncus，上调了Bacteroides和Parabacteroides。功能预测显示AA扰乱了氧化磷酸化、细菌趋化性等多个通路。重要的是，A-B组小鼠的肠道菌群结构及功能预测谱与对照组高度相似，成功逆转了AA引起的菌群失调。这首次将AA的毒性表现与肠道菌群紊乱联系起来，并表明A-B超分子通过维持菌群稳态参与了其系统保护作用。
5. 转录组与机制探索结果：这是阐明减毒分子机制的核心。 * 基因表达全局变化：与对照组相比，AA组有超过2000个基因表达发生显著改变（1114个上调，1048个下调），而A-B组仅约300个基因发生改变。更重要的是，将A-B组与AA组比较，发现了约2000个DEGs，其中超过三分之二与“AA组 vs 对照组”的DEGs重叠但表达趋势相反。聚类分析显示A-B组的基因表达谱接近对照组，而与AA组和A&B组迥异。这从全基因组层面证明A-B超分子几乎完全阻断了AA引起的基因表达紊乱。 * 通路富集：AA激活的DEGs主要富集在免疫系统（如TNF信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用）和癌症相关通路（如癌症中的蛋白聚糖、PI3K-Akt信号通路）。A-B处理则逆转了这些通路的激活状态。 * 免疫细胞浸润：GSVA和标志基因表达分析显示，AA处理显著诱导了肾脏中NK细胞和中性粒细胞的浸润。免疫组化证实，AA组肾脏中NK细胞标志物NCR1和中性粒细胞标志物NE的表达强烈上调，而A-B组则与对照组无显著差异。这表明AA触发了强烈的先天免疫炎症反应，而A-B抑制了此过程。 * 关键信号通路验证：AA组肾脏中NF-κB p65和MAPK p38的磷酸化水平（激活形式）以及下游炎症因子TNF、IL-6的表达均显著上调。A-B组则有效抑制了这些关键炎症信号分子的激活。
结果逻辑链：化学表征证明了A-B稳定结构的形成→体内实验证实该结构能有效防止AA引起的急性肾损伤和体重减轻→菌群分析揭示A-B能维持肠道稳态，这是整体毒性降低的表现之一→转录组学将保护作用定位到基因层面，发现A-B逆转了AA引起的免疫与癌症通路激活→进一步的免疫学和蛋白分析锁定NF-κB和MAPK炎症通路以及NK细胞/中性粒细胞浸润是AA毒性的关键效应环节，也是A-B发挥作用的主要靶点。
五、 研究结论与价值 本研究得出明确结论：传统中药成分小檗碱（Ber）与马兜铃酸（AA）能够通过分子间作用力自组装形成一种新型的、稳定的线性异质超分子（A-B）。这种自组装策略通过物理性屏蔽AA的毒性基团（如羧基），阻止其代谢为有毒的马兜铃内酰胺（aristololactam）和形成DNA加合物，从而在根本上中和了AA的急性肾毒性。其生物学保护机制涉及维持肠道菌群稳态，并特别通过抑制NF-κB和MAPK p38信号通路的激活，减少NK细胞和中性粒细胞在肾脏的浸润，进而阻断下游炎症因子风暴，最终避免急性肾损伤的发生。
科学价值：本研究首次从超分子化学角度，为中药“配伍减毒”的经典理论提供了直接的、分子水平的化学与生物学机制阐释。它将传统经验与现代超分子科学、系统生物学、微生物组学紧密结合，展示了一种理解复杂中药方剂作用原理的创新研究范式。 应用价值：该工作为安全利用含AA等有毒成分的药用资源开辟了新途径。提出的“利用生物相容性植物化学物直接自组装以中和毒性”的策略，具有通用性潜力，可用于设计新一代低毒或无毒的中药复合物或天然药物递送系统，具有重要的转化医学前景。
六、 研究亮点 1. 创新性的研究视角：将超分子自组装概念引入中药配伍研究，为阐释“减毒”机制提供了全新的化学语言和物理图像。 2. 严谨的多维度验证：从化学结构表征、到体内外毒性评价、再到肠道微生态和转录组/蛋白组多层机制探索，构成了一个完整、闭环的证据链，论证扎实。 3. 关键发现：明确了“自组装”是减毒的必要条件（机械混合物无效）；首次将AA毒性、肠道菌群失调与肾脏免疫炎症通路系统性地联系起来；发现A-B能同时实现“减毒”（对AA）和“存效”（保留Ber抗菌活性）。 4. 方法学的整合：综合运用了ITC、ROESY 2D NMR等深入的表征技术，以及16S rDNA测序、RNA-Seq、GSVA等系统生物学方法，展现了现代交叉学科研究的技术优势。
七、 其他有价值内容 研究在讨论部分指出，AA的致突变特征（如引起AT-TA颠换）与癌症发生相关，而本研究显示A-B能阻断AA激活的癌症相关通路，提示其可能具有长期预防AA相关肾癌的潜力，这为后续研究提供了重要方向。此外，文中提及的A-B制备方法（一步法）简单易行，有利于未来可能的规模化制备和应用探索。