本研究由上海交通大学医学院附属胸科医院胸外科的王庆（Qing Wang）、海军军医大学长征医院心胸外科的薛小飞（Xiaofei Xue）和王培（Pei Wang）等为共同第一作者，通讯作者为海军军医大学长征医院心胸外科的肖健（Jian Xiao）和上海交通大学医学院附属同仁医院心内科的蒋琪霞（Qixia Jiang）。该研究于2024年10月2日在线发表于《Frontiers in Pharmacology》期刊，文章DOI为10.3389/fphar.2024.1435282。
研究背景
心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤是急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）再灌注治疗中面临的主要障碍。再灌注策略包括经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术和溶栓治疗，但I/R损伤可导致再灌注性心律失常、心肌顿抑、微血管阻塞和致死性心肌再灌注损伤，严重限制了再灌注治疗的临床获益。硫化氢（hydrogen sulfide, H₂S）是一种内源性气体递质，在心血管系统稳态中发挥重要作用，既往研究表明H₂S对I/R损伤具有保护作用。哺乳动物细胞内产生H₂S的酶主要包括胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-synthase, CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase, CSE/CGL）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase, 3-MST）。心脏特异性过表达CSE可增加内源性H₂S产生，从而减少梗死面积并改善心功能。然而，外源性H₂S的临床应用面临诸多问题，包括全身性递送导致的血压急性改变、中枢神经毒性和呼吸抑制等副作用。传统的NaHS注射或腺病毒介导的CSE基因治疗存在效率低和全身副作用的问题。因此，如何实现H₂S的局部递送或CSE在心脏的局部过表达，以减少副作用并提高疗效，成为该领域的重要研究方向。
纳米载体作为一种新型递送系统，具备细胞靶向能力，可用于转运基因、药物和其他治疗剂。量子点（quantum dots, QDs）作为无机/非金属纳米粒子，具有良好的光稳定性、较强的荧光强度和多样的发射波长等优点。血管紧张素1（angiotensin 1, AT1）肽属于肾素-血管紧张素系统（renin–angiotensin system, RAS），由于缺血心肌中AT1受体高表达，AT1肽可特异性靶向缺血心肌。本研究旨在构建一种AT1肽偶联的CdSe/ZnS量子点纳米载体，用于向心肌靶向递送CSE质粒，以增强局部H₂S产生，减轻I/R损伤，并探讨其潜在机制。
研究流程
本研究首先进行了纳米载体的合成与表征。油溶性CdSe/ZnS核壳量子点购自苏州星硕纳米科技公司，通过谷胱甘肽（glutathione, GSH）进行相转移，并用羧基-聚乙二醇-羧基（carboxyl-PEG-carboxyl）交联，获得PEG化聚合物包封的量子点。随后将AT1靶向肽（甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸-缬氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-组氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸，末端含赖氨酸残基）通过末端氨基与量子点表面的羧基共价偶联，获得肽-PEG量子点（peptide-PEG QDs, PPQDs）。DNA质粒的包载采用聚乙烯亚胺（polyvinylimide, PEI，分子量2000）进行静电自组装。通过琼脂糖凝胶电泳优化PEI/QD比例，确定PEI/QD摩尔比为0.3时PEI适量过量，可制备DNA载体簇；进一步优化PEI-QD/DNA比例，确定摩尔比为0.5时大部分质粒被包裹在QD簇中。透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）显示谷胱甘肽修饰的CdSe/ZnS量子点平均粒径约为7–10 nm，分散均匀；靶向量子点簇负载DNA质粒后形态良好。琼脂糖凝胶电泳验证了不同表面性质量子点的迁移行为，确认了PEG和靶向肽的成功修饰。
在体内实验中，研究采用雄性SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠（体重250–300 g）和C57BL6/J雄性小鼠（体重18–22 g）。动物分为三组：假手术组（sham组）、I/R组和CSE组。I/R模型通过结扎左前降支（left anterior descending, LAD）冠状动脉30分钟后再灌注24小时建立。I/R组在再灌注前立即静脉注射20 μl空载体纳米载体，CSE组注射20 μl含CSE质粒的纳米载体，假手术组仅开胸不结扎LAD。体内荧光成像系统（Bruker In Vivo F Pro系统，激发波长410 nm，发射波长700 nm）用于全动物成像分析，结果显示AT1偶联的纳米载体在心肌中显著富集，荧光强度明显强于空载体组。取大鼠心肌、骨骼肌、肝脏和肺组织进行Western blot检测CSE表达，结果表明AT1组心肌组织中CSE蛋白表达高于对照组，而骨骼肌、肝脏和肺组织中两组无显著差异，证实了纳米载体可靶向缺血心肌且不影响其他器官。
在体外实验中，分离1–3日龄SD大鼠乳鼠心肌细胞进行培养。将细胞分为四组：N+vector组（常氧条件下培养50 μl空载体纳米载体24小时）、N+CSE组（常氧条件下培养50 μl CSE纳米载体24小时）、HR+vector组（缺氧复氧条件下培养50 μl空载体纳米载体）和HR+CSE组（缺氧复氧条件下培养50 μl CSE纳米载体）。缺氧条件为1% O₂、5% CO₂、94% N₂培养24小时，随后在5% CO₂和95%空气条件下复氧6小时。荧光显微镜观察显示CSE纳米载体呈红色荧光并广泛分布于心肌细胞内，表明PPQDs对心肌细胞具有较高的转染效率。Western blot结果显示CSE纳米载体组CSE表达水平显著高于载体组。
在体内保护效应评价中，采用TTC/Evans蓝染色测量心肌梗死面积，超声心动图（VisualSonics Vevo 2100，B-mode，30 MHz探头）评估心功能，TUNEL染色检测细胞凋亡率，透射电子显微镜观察心肌超微结构和线粒体自噬。在体外检测中，采用CCK-8试剂盒检测心肌细胞活力，ATP检测试剂盒检测ATP含量，LDH检测试剂盒检测乳酸脱氢酶活性，Western blot检测内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）相关蛋白（CHOP、GRP78、eIF2α）和线粒体自噬相关蛋白（Parkin、NIX、ATG7、LC3）的表达。此外，构建CHOP腺病毒载体，在建立HR模型前24小时给予腺病毒以过表达CHOP，将细胞分为正常对照组、HR组、HR+CSE组和Ad-CHOP+HR+CSE组，以验证CHOP在CSE保护效应中的作用。
数据采用GraphPad Prism 7.0进行分析，连续数据以均值±标准误（SEM）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及事后Tukey检验，P<0.05为差异有统计学意义。
主要结果
纳米载体表征结果表明，谷胱甘肽修饰的量子点迁移距离最远且无明显拖尾，表明粒径和电荷均一性良好；PEG修饰后电泳条带变宽、迁移距离缩短，说明PEG成功修饰在量子点表面；靶向肽修饰后条带进一步变宽，表明靶向肽与PEG化量子点结合并导致部分量子点聚集。PEI/QD摩尔比为0.2时几乎所有量子点被阻滞在加样孔中，说明该比例下PEI足以通过静电自组装使量子点团聚；最终选择PEI/QD摩尔比为0.3。PEI-QD/DNA摩尔比为0.5时大部分质粒被包裹在QD簇中，确定了最佳包载条件。
体内荧光成像显示AT1偶联纳米载体在心肌局部荧光强度显著强于空载体组，证实了AT1肽的靶向性。Western blot结果显示AT1组心肌组织CSE蛋白表达高于对照组，而骨骼肌、肝脏和肺组织中两组无显著差异。体外实验显示CSE纳米载体在心肌细胞中广泛分布，CSE表达水平显著高于载体组，表明PPQDs可高效转染心肌细胞并提高CSE表达。
在体内I/R模型中，TTC/Evans蓝染色显示CSE组小鼠心肌梗死面积显著小于I/R对照组（P<0.01）；超声心动图显示CSE纳米载体可提高I/R后的射血分数（ejection fraction, EF）（P<0.05）。透射电子显微镜观察到I/R组线粒体体积减小、嵴丢失增多、自噬泡内含有较多受损线粒体，而CSE纳米载体注射后异常线粒体超微结构得到逆转。体外实验中，CCK-8结果显示HR损伤后心肌细胞活力下降，但CSE组活力高于对照组（P<0.01）；ATP检测显示HR损伤后ATP含量下降，CSE组ATP含量高于对照组（P<0.01）；LDH检测显示CSE组细胞培养基中LDH含量低于对照组（P<0.01）；TUNEL染色显示CSE组凋亡率显著低于I/R组（P<0.01）。这些结果表明CSE纳米载体在体内和体外均具有显著的心肌保护作用。
在机制研究中，Western blot结果显示HR处理后ERS相关蛋白CHOP、GRP78和eIF2α表达升高，而加入CSE纳米载体后这些蛋白表达下降；线粒体自噬相关蛋白Parkin、NIX和ATG7在HR模型中表达升高，CSE纳米载体可抑制其表达。当用腺病毒载体过表达CHOP后，CSE对线粒体自噬的抑制作用被逆转，表明CSE通过CHOP/GRP78/eIF2α信号通路抑制ERS和线粒体自噬，从而发挥心肌保护作用。
结论与意义
本研究成功构建了一种心肌特异性纳米载体系统PPQDs，可携带CSE质粒靶向转染心肌细胞并提高CSE表达。CSE纳米载体通过减少细胞凋亡、抑制ERS和线粒体自噬信号通路，减轻I/R损伤并保护心功能。该研究为心肌I/R损伤提供了一种有前景的靶向、无副作用的治疗策略，具有临床转化潜力。
研究亮点
本研究的亮点在于：第一，利用AT1肽偶联的CdSe/ZnS量子点实现了心脏特异性基因递送，克服了传统H₂S递送方法效率低和全身副作用的问题；第二，通过优化PEI/QD和PEI-QD/DNA比例，建立了高效的质粒包载和转染体系；第三，利用量子点的荧光特性实现了体内示踪与靶向验证的一体化；第四，阐明了CSE通过CHOP/GRP78/eIF2α信号通路调控ERS和线粒体自噬的分子机制，为I/R损伤的治疗提供了新的理论依据；第五，该纳米载体系统具有潜在的临床转化价值，为心肌I/R损伤的靶向基因治疗提供了新思路。
此外，讨论部分还指出了该研究向临床转化所需考虑的关键因素，包括人体生物相容性和安全性研究、剂量优化、人体组织靶向效率验证、监管审批、生产可扩展性和成本效益以及全面的临床试验评估等，为进一步研究指明了方向。