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研究团队与发表信息

本研究由Qi Yu（浙江大学医学院）、Li Liu（浙江大学医学院附属儿童医院）、Mengjie Du（浙江大学医学院第二附属医院）等共同第一作者完成，通讯作者为Till Marquardt（德国亚琛工业大学）和Liang Wang（浙江大学医学院）。研究发表于Gastroenterology期刊（2024年，第166卷，第1085–1099页），题为《Sacral Neural Crest-Independent Origin of the Enteric Nervous System in Mouse》。

学术背景

研究领域：发育神经生物学与胃肠病学，聚焦于肠神经系统（Enteric Nervous System, ENS）的胚胎起源。
研究动机：传统观点认为，哺乳动物ENS由颅侧迷走神经嵴细胞（Vagal Neural Crest Cells, VNCCs）和骶侧神经嵴细胞（Sacral Neural Crest Cells, SNCCs）共同形成，但SNCCs的具体贡献一直存在争议。这一争议源于缺乏区分VNCCs和SNCCs的分子标记，且既往研究依赖体外共培养实验，可能无法真实模拟体内环境。
研究目标：通过遗传谱系追踪和三维重建技术，明确SNCCs是否对小鼠ENS发育有实质性贡献，并重新评估ENS的胚胎起源模型。

研究流程与方法

1. 遗传谱系追踪模型的构建

• 基因工程小鼠：开发了新型转基因小鼠品系Wnt1DreERT2，通过他莫昔芬（Tamoxifen, TM）时间依赖性诱导重组，选择性标记不同轴向来源的神经嵴细胞（NCCs）。
  
  • 标记策略：
    
  • 早期NCCs（含VNCCs）：E7.5注射TM，标记所有NCCs（包括VNCCs）。
    
  • 晚期NCCs（仅SNCCs/尾侧躯干NCCs）：E9.5注射TM，仅标记骶侧和尾侧躯干NCCs（排除VNCCs）。
    
• 双重组酶系统：结合Sox10CreERT2和Phox2bFlp小鼠，实现VNCCs与自主神经前体细胞（Autonomous Precursor Cells, ANPs）的双重谱系追踪。
  

2. 组织分析与三维重建

• 免疫荧光与原位杂交：检测Sox10（神经嵴标记）、Phox2b（自主神经元标记）和报告基因（YFP/Tomato）的表达。
  
• 三维重建：使用Amira 3D 2020.2软件对盆腔神经丛和后肠进行三维建模，精确定位SNCCs衍生细胞的分布。
  

3. 共培养实验验证

• 神经组织-后肠共培养：将盆腔神经节（Pelvic Ganglia, PGs）、背根神经节（Dorsal Root Ganglia, DRGs）等与后肠共培养，观察细胞迁移特异性。
  
• 阴性对照：加入交感神经节（SCGs）和腹侧神经管（Ventral Neural Tube, VNT）组织，验证迁移行为的非特异性。
  

4. 数据分析

• 定量统计：计算不同轴向NCCs对ENS的贡献比例（如YFP+细胞在肠道的占比）。
  
• 显著性检验：采用GraphPad Prism 9进行t检验，阈值设为*p < 0.05*。
  

主要研究结果

1. SNCCs不参与ENS形成：

   • 谱系追踪：E9.5 TM标记的SNCCs（YFP+）仅定位于盆腔神经丛和后肠周围组织，未侵入肠壁（平均每胚胎仅0.9个YFP+细胞）。
     
   • 三维重建：SNCCs衍生细胞紧贴肠道血管或神经纤维，但未与ENS前体混合。
     

2. Phox2b表达动态差异：

   • VNCCs在迁移早期即表达Phox2b，而SNCCs仅在定居自主神经节后启动表达，提示两者分化路径不同。
     

3. 共培养实验的局限性：

   • PGs、DRGs、VNTs等组织均能非特异性迁移至后肠，表明体外实验可能高估SNCCs的贡献。
     

4. VNCCs为ENS唯一来源：

   • Phox2bFlp;R26FlTG小鼠中，100%的ENS细胞（包括神经元和胶质细胞）显示Tomato标记，证实ENS完全源于VNCCs。
     

结论与意义

1. 理论修正：

   • 推翻了“SNCCs补充性贡献ENS”的传统模型，提出哺乳动物ENS仅由VNCCs单一起源的新理论。
     
   • 建议将SNCCs和躯干NCCs统称为“躯干NCCs（Trunk NCCs, TNCCs）”，以更准确反映其发育贡献。
     

2. 临床意义：

   • 先天性巨结肠（Hirschsprung’s Disease, HSCR）：研究解释了HSCR患者后肠神经节缺失的机制——VNCCs迁移受阻无法被SNCCs补偿，为细胞治疗策略（如靶向VNCCs的干细胞移植）提供理论依据。
     

3. 技术贡献：

   • 开发了时间特异性双重组酶谱系追踪系统，为神经嵴研究提供新工具。
     
   • 通过三维重建技术解决了盆腔神经丛与肠道结构的空间定位难题。
     

研究亮点

1. 创新性方法：

   • 首次实现SNCCs与VNCCs的体内精准区分，避免了传统移植实验的干扰。
     
   • 结合遗传学与成像技术，提供高分辨率发育动态数据。
     

2. 争议解决：

   • 澄清了鸟类与哺乳动物ENS起源的差异（鸟类SNCCs通过Remak神经贡献ENS，而哺乳动物无此途径）。
     

3. 跨学科价值：

   • 成果涉及发育生物学、神经科学和胃肠病学，为相关领域研究提供范式参考。
     

其他有价值内容

• 补充数据：研究公开了所有基因型鉴定引物序列和抗体信息（补充方法），便于重复实验。
  
• 伦理合规：实验通过浙江大学动物伦理委员会审批，符合国际标准。
  

（全文约2000字）