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木犀草素及其葡萄糖醛酸代谢物的肝脏摄取机制研究：OATP1B1与OATP1B3的关键作用

一、研究团队与发表信息
本研究由苏州大学药学院的Hui Zhi（第一作者）、南京医科大学附属苏州科技城医院临床药学实验室的Yuan Yuan（共同第一作者）等团队合作完成，通讯作者为苏州大学的Jianqing Ruan教授和南京医科大学附属苏州科技城医院的Cheng Wang教授。研究论文《The Importance of OATP1B1 and 1B3 in the Liver Uptake of Luteolin and Its Consequent Glucuronidation Metabolites》于2020年2月3日在线发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》（J. Agric. Food Chem.），DOI号为10.1021/acs.jafc.9b06954。

二、研究背景与目标
木犀草素（Luteolin）是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种药理活性。然而，其口服生物利用度较低，主要原因是其在肝脏中经UDP-葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyltransferases, UGTs）催化生成葡萄糖醛酸结合物（glucuronidation metabolites），并通过胆汁排泄。尽管UGTs介导的木犀草素代谢已有研究，但其区域选择性葡萄糖醛酸化（regio-selective glucuronidation）及代谢产物在肝脏中的摄取机制尚不明确。

有机阴离子转运多肽（Organic Anion Transporting Polypeptides, OATPs）是肝脏中重要的摄取转运体，负责内源性物质（如胆汁酸）和外源性物质（如药物及其代谢物）的转运。OATP1B1和OATP1B3在肝细胞基底膜高表达，可能参与木犀草素及其代谢物的肝脏摄取，但此前未有研究探讨这一问题。

本研究旨在：
1. 明确木犀草素在人类肝微粒体（human liver microsomes, HLMs）及重组UGT酶中的区域选择性葡萄糖醛酸化特征；
2. 探究OATP1B1和OATP1B3对木犀草素及其葡萄糖醛酸代谢物（如luteolin-3’-O-glucuronide, L-3’-G和luteolin-7-O-glucuronide, L-7-G）的转运作用；
3. 通过小鼠体内实验验证代谢物的药代动力学特征，阐明OATP1B1/1B3在木犀草素肝脏处置中的关键作用。

三、研究方法与流程
研究分为体外代谢、体外转运和体内药代动力学三部分。

1. 体外代谢实验

   • 研究对象：人类肝微粒体（HLMs）及12种重组UGT酶（UGT1A1、1A3、1A6、1A7、1A8、1A9、1A10、2B4、2B7、2B15、2B17）。
     
   • 实验设计：
     
     • 木犀草素（100 μM）与HLMs或UGT酶孵育，检测生成的葡萄糖醛酸代谢物（L-3’-G、L-7-G和另一种暂定为L-4’-G的代谢物）。
       
     • 通过LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）分析代谢物生成速率，并计算动力学参数（Km、Vmax、内在清除率CLint）。
       
   • 关键方法：采用Michaelis-Menten模型或底物抑制模型拟合动力学数据，使用Prism 5.0软件分析。
     

2. 体外转运实验

   • 研究对象：转染OATP1B1或OATP1B3的中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）及空白对照细胞（CHO-K1）。
     
   • 实验设计：
     
     • 检测木犀草素、L-3’-G和L-7-G在OATP1B1/1B3细胞中的摄取效率，以典型底物瑞舒伐他汀（rosuvastatin）作为阳性对照。
       
     • 使用OATP抑制剂利福平（rifampin）验证转运特异性。
       
     • 通过动力学分析计算L-3’-G的Km和Vmax值。
       

3. 体内药代动力学实验

   • 研究对象：30只C57小鼠，静脉注射木犀草素（20 mg/kg）。
     
   • 实验设计：
     
     • 采集不同时间点的血浆、肝脏和胆汁样本，检测木犀草素、L-3’-G和L-7-G的浓度。
       
     • 计算药时曲线下面积（AUC）以评估代谢物的暴露量差异。
       

四、主要研究结果
1. 木犀草素的区域选择性葡萄糖醛酸化
- HLMs主要生成L-3’-G和L-7-G，其中L-3’-G的生成亲和力更高（Km=4.28 μM，CLint=0.61 L/min/mg）。
- UGT1A9是催化L-3’-G和L-7-G生成的主要酶，而UGT1A1对L-3’-G的催化效率最高（CLint=1.00 L/min/mg）。

1. OATP1B1/1B3对代谢物的选择性摄取

   • OATP1B1和OATP1B3显著介导L-3’-G的摄取（摄取倍数分别为8.83和3.30倍），但对木犀草素和L-7-G无显著转运活性。
     
   • 利福平可完全抑制L-3’-G的摄取，证实OATP依赖性转运机制。
     
   • 动力学分析显示，OATP1B1对L-3’-G的亲和力（Km=1.61 μM）和容量（Vmax=83.85 nmol/min/mg）均高于OATP1B3。
     

2. 小鼠体内药代动力学特征

   • 血浆中L-3’-G的AUC0-8（8981.8 ng/mL·h）显著高于木犀草素（5114.8 ng/mL·h）和L-7-G（2221.2 ng/mL·h）。
     
   • 肝脏中L-3’-G的浓度是L-7-G的4倍，支持OATP介导的选择性摄取。
     
   • 胆汁中两种葡萄糖醛酸代谢物浓度相近，提示其通过主动外排进入胆汁。
     

五、研究结论与意义
本研究首次阐明：
1. 木犀草素的肝脏葡萄糖醛酸化具有区域选择性，UGT1A9和UGT1A1是主要催化酶；
2. OATP1B1/1B3特异性介导L-3’-G的肝脏摄取，导致其在肝脏中高暴露；
3. 这一机制解释了木犀草素代谢物的组织分布差异，为优化其给药策略提供了理论依据。

六、研究亮点
1. 方法创新：结合体外酶动力学、转运体功能分析和体内药代动力学，系统解析木犀草素的代谢-转运机制。
2. 发现新颖性：首次揭示OATP1B1/1B3对木犀草素代谢物的选择性转运作用。
3. 应用价值：为预测木犀草素与其他OATP底物药物（如他汀类）的相互作用提供参考。

七、其他价值
研究结果提示，L-3’-G可能是木犀草素的主要活性代谢物，其肝脏高浓度可能与其肝保护作用相关，未来可进一步探索其药理活性。