关于“3D打印具有高细胞密度和异质性微环境的血管化肝组织”研究的学术报告

本文报道了一项由清华大学机械工程系生物制造中心、北京市生物制造与快速成形技术重点实验室以及“生物制造与工程活系统”创新国际人才基地（111基地）的研究团队，联合美国德雷塞尔大学机械工程系的研究人员共同完成的原创性研究。该研究由Yongcong Fang、Mengke Ji、Yi Yang、Yihan Guo、Ruobin Sun、Ting Zhang、Wei Sun和Zhuo Xiong（通讯作者）等人合作进行。研究成果以题为“3D printing of vascularized hepatic tissues with a high cell density and heterogeneous microenvironment”的论文形式，已获学术期刊《Biofabrication》接受发表（录用稿版本，文章ID：ace5e0，DOI: 10.¹⁰⁸⁸⁄₁₇₅₈-5090/ace5e0）。根据出版信息，该文在正式出版后将有12个月的禁运期。

一、 研究背景与目标

本研究的核心科学领域是组织工程与再生医学，具体聚焦于三维（3D）生物打印技术。3D挤出式生物打印因其能够精确沉积细胞和生物相容性材料（即生物墨水，bioink）而备受关注。然而，该技术面临一个关键瓶颈：理想的生物墨水需要在保证良好打印性能的同时，保护细胞在打印过程中免受损伤，并且需要达到接近天然组织的高细胞密度以促进细胞间相互作用和快速组织形成。传统基于单个细胞和水凝胶的生物墨水，其细胞密度（通常为0.1–10 ×10^6 cells/cm³）远低于许多天然组织（如心脏为1–5 ×10^8 cells/cm³）。高密度的分散细胞会严重损害生物墨水的可打印性和细胞活性，这构成了一个难以调和的矛盾。

近年来，使用多细胞球体（spheroids）作为基本构建单元来构建高细胞密度组织成为一种有前景的策略。然而，现有方法存在局限：例如，“拾取-放置”法速度慢；使用球体作为悬浮浴进行模塑的方法难以构建复杂外部结构；而将稀疏的球体封装在水凝胶中的方法则限制了球体融合和组织重塑。因此，开发一种兼具高细胞密度、良好打印性并能支持复杂组织构建的通用型生物墨水，是当前领域的重要挑战。

基于此，本研究旨在解决上述矛盾。研究团队提出并开发了一种新型的“基于颗粒状细胞聚集体的双相生物墨水”（Granular Cell Aggregate-based Biphasic bioink, GCAB bioink）。该生物墨水的核心目标在于：1）实现接近生理水平的高细胞密度；2）保持良好的挤出打印流变特性（如剪切稀化、剪切恢复）；3）打印后能呈现类似软生物组织的超弹性力学行为；4）能够构建具有异质性微环境和可灌注血管网络的功能性组织，特别是肝组织。

二、 研究详细流程与方法

本研究的工作流程系统而完整，主要包括以下几个关键步骤：

1. 细胞球体的规模化制备与表征： 研究以HepG2（人肝癌细胞系）作为模型肝细胞，使用定制化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微孔板（含10,000个微孔）高通量生成尺寸均一的细胞球体。将HepG2单细胞以每微孔约200个细胞的密度接种，通过离心促进聚集。细胞在24小时内自组装成球体，培养3天后收获。研究人员对收获的球体进行了直径分布统计（约165 ± 20 μm）、活死染色评估细胞活性（大部分存活）、细胞骨架（F-actin）染色观察细胞间紧密连接，并使用Ki67免疫染色检测细胞增殖状态（仅约10%细胞增殖，类似天然组织的静息状态）。此外，研究还成功制备了人间充质干细胞（MSC）球体，以验证GCAB生物墨水的普适性。

2. GCAB生物墨水的制备与表征： GCAB生物墨水的制备方法是将密集堆积的HepG2球体与5 wt%的甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶前体溶液混合。其中，细胞球体作为分散相占据主要空间，GelMA前体溶液作为连续相整合球体。通过离心和洗涤步骤获得紧密堆积的球体-GelMA混合物。研究量化了GCAB生物墨水的细胞密度（约1.7×10^8 cells/cm³）。作为对照，制备了传统分散细胞负载（Dispersive Cell-laden, DCL）生物墨水（5% GelMA，细胞密度7.5×10^6 cells/cm³）。

3. 生物墨水流变学与可打印性评估： 使用流变仪系统比较了GCAB生物墨水、无细胞（Cell-free, CF）GelMA墨水和DCL生物墨水的流变性能。测试包括：剪切速率扫描评估剪切稀化行为；应变扫描评估屈服应力；交替高低应变循环测试评估自愈合性能；以及温度扫描评估热敏性。结果显示，所有生物墨水均具备剪切稀化、屈服应力和快速自愈合特性，适合挤出打印。GCAB生物墨水具有更高的储能模量和更低的屈服应力，有利于全方位打印。特别的是，由于球体的“堵塞”（jammed）特性，GCAB生物墨水对温度的敏感性降低，拓宽了打印的温度窗口。

在可打印性方面，研究使用商业3D生物打印机，通过21G针头（内径510 μm）进行打印。优化了打印参数（速度5 mm/s，挤出速率1.8 μl/s），成功打印了高保真度的双环结构和网格结构。通过使用表达绿色荧光蛋白（GFP）的球体，直观展示了墨水的颗粒形态和层间互连性。研究还采用基于Carbopol的悬浮介质进行嵌入式打印，成功构建了具有悬垂结构和空腔的复杂肝脏模型、螺旋图案和开放腔室结构，证明了其构建复杂解剖结构的能力。

4. 打印结构的细胞活性、增殖与力学性能测试： * 细胞活性与增殖： 通过活死染色评估打印前后细胞活性。GCAB生物墨水打印后细胞活性从94.8%降至83.7%，略低于DCL生物墨水（89.2%），表明挤出剪切力和光交联自由基聚合对细胞有负面影响，但存活率仍处于较高水平。CCK-8增殖实验表明，GCAB组比DCL组增殖更快，归因于更紧密的细胞接触。 * 力学性能： 通过单轴压缩试验评估打印圆柱体样品（直径8 mm，高5 mm）的力学性能。比较了低密度DCL墨水（LDCL-ink）、高密度DCL墨水（HDCL-ink）和GCAB墨水。LDCL-ink因细胞密度低，弹性模量最高（62.7±4.5 kPa）。HDCL-ink和GCAB-ink在相同细胞密度下弹性模量无显著差异（分别为32.9±4.9 kPa和33.7±6.2 kPa），表明是细胞数量而非细胞形态（单个细胞或聚集体）主要影响力学性能。GCAB打印的构建体可承受约50%的应变并弹性恢复数百次，显示出优异的循环压缩性能。

5. 构建异质性微环境以增强血管化和肝功能： 为了模拟肝脏的异质性细胞微环境，研究将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）加入GCAB生物墨水的水凝胶相中（HepG2球体与HUVECs比例5:1）。同时设置对照组，将单个HepG2细胞与HUVECs直接混合打印（DCL bioink组）。打印网格状肝组织构建体并在混合培养基中培养7天。 * 血管形成评估： 通过荧光显微镜观察表达红色荧光蛋白（RFP）的HepG2和表达绿色荧光蛋白（GFP）的HUVECs的分布。在GCAB组，HUVECs主要局限在球体间隙区域，并在24小时内快速组装成具有伸长形态的毛细血管样结构，细胞内出现空泡并融合成管腔，这种结构可持续至少7天。免疫荧光染色血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin）进一步证实了内皮细胞连接完整性。而在DCL组，HUVECs大多保持圆形，仅在外围铺展，血管形成程度显著低于GCAB组。定量分析证实GCAB组血管覆盖面积更大。 * 肝功能评估： 通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清中白蛋白（Albumin）分泌和尿素（Urea）产生水平（均归一化到细胞总数）。结果显示，GCAB组的白蛋白和尿素表达水平显著高于DCL组。通过实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝细胞标志物白蛋白（ALB）和甲胎蛋白（AFP）的基因表达，GCAB组的表达水平也显著更高。这些结果表明GCAB生物墨水更高的细胞密度和更紧密的细胞接触促进了HUVECs的增殖和肝细胞功能的增强。

6. 同步打印可灌注血管网络的高密度功能性肝组织： 为了给高细胞密度的厚组织提供营养，研究采用牺牲打印策略，同步构建可灌注的血管网络。具体方法是使用双喷嘴交替打印：一个喷嘴打印负载HUVECs的7.5 wt%明胶（Gelatin）生物墨水（牺牲材料），另一个喷嘴打印GCAB生物墨水。打印平台温度设为12°C以确保明胶快速凝胶化提供临时支撑。成功打印了厚度约4 mm的立方体肝组织构建体，其中GCAB生物墨水与负载HUVECs的明胶生物墨水以正交方向交替打印。打印并交联后，在37°C孵育30-60分钟，使明胶模板液化形成血管通道（液化明胶保留2小时后移除，以便细胞附着于通道壁）。通过扫描电镜（SEM）和荧光显微镜观察发现，第1天HUVECs均匀附着在通道表面（原位内皮化策略效率高），第3天增殖形成连续的内皮层，第7天观察到可灌注血管网络向周围GCAB组织内侵袭生长。

三、 主要研究结果

1. 成功开发了GCAB生物墨水： 该墨水以密集堆积的细胞球体（~1.7×10^8 cells/cm³）为分散相，GelMA水凝胶为连续相，兼具高细胞密度（接近生理水平）、高细胞活性（打印后~83%）、优异的剪切稀化/恢复流变特性、拓宽的打印温度窗口以及类似天然组织的超弹性力学行为。
2. 证明了GCAB生物墨水卓越的可打印性和结构保真度： 既能进行空气中直接打印复杂网格结构，也能在悬浮浴中打印具有悬垂和空腔的解剖模型。
3. 验证了GCAB生物墨水在构建异质性组织微环境方面的优势： 将HUVECs引入水凝胶相后，打印的肝组织构建体表现出更快速、更显著的毛细血管网络自组装，且血管化程度显著高于传统DCL生物墨水组。
4. 证实了高密度和异质性微环境对组织功能的促进作用： GCAB组打印的肝组织构建体在肝特异性功能（白蛋白分泌、尿素合成）和相关基因表达上均显著优于DCL对照组，表明紧密的细胞间接触有利于功能成熟。
5. 实现了高细胞密度组织与可灌注血管网络的同步制造： 通过结合GCAB生物墨水与负载内皮细胞的牺牲明胶墨水进行多材料打印，成功构建了内部嵌有内皮化通道的厚组织（~4 mm），该通道网络可灌注并能在培养过程中向内生长，为解决厚组织营养输送难题提供了可行方案。

这些结果层层递进：首先证明了GCAB墨水作为新型生物墨水的可行性（结果1，2）；进而利用其特性构建异质性肝组织，证明了其在促进血管化和功能方面的优越性（结果3，4）；最后，集成牺牲打印技术，展示了构建兼具高细胞密度和功能性血管网络的复杂组织的潜力（结果5），完整地回答了研究目标。

四、 研究结论与价值

本研究得出结论：GCAB生物墨水作为一种通用策略，扩展了挤出式生物打印的生物墨水库。它提供了前所未有的高细胞密度、良好细胞活性和超弹性行为的生物打印能力。利用GCAB生物墨水，研究者成功打印了具有异质性细胞微环境的血管化肝组织构建体，由于更紧密的细胞间相互作用，加速了血管化和组织重塑。进一步地，通过与牺牲打印策略结合，制造了具有可灌注血管网络的功能性高密度肝组织，以满足其代谢需求。

该研究的科学价值在于：1）提出并验证了“颗粒状细胞聚集体双相生物墨水”这一创新概念，为解决生物打印中高细胞密度与良好打印性之间的矛盾提供了新思路；2）深入揭示了基于球体的生物墨水在促进细胞间相互作用、血管网络自组装和组织功能方面的机制优势；3）展示了多材料生物打印策略在构建复杂、血管化组织方面的强大潜力。

其应用价值体现在为制造用于药物筛选、疾病模型和未来移植的功能性组织器官开辟了新途径。通过结合GCAB生物墨水与先进的生物打印策略，有望实现具有接近生理细胞密度、血管系统和功能的个性化器官特异性组织的制造。

五、 研究亮点

1. 创新性的生物墨水设计： 首次提出并实现了以密集堆积的细胞球体作为“颗粒材料”构成双相生物墨水，巧妙地将高细胞密度与良好的挤出打印流变学特性结合起来。
2. 解决关键瓶颈问题： 直接针对生物打印领域长期存在的高细胞密度与打印性难以兼顾的核心挑战，提出了有效的解决方案。
3. 功能导向的组织构建： 不仅关注结构的打印，更侧重于构建具有异质性微环境（肝细胞球体+内皮细胞）和可灌注血管网络的功能性组织，并提供了详实的生物学功能数据（血管化、白蛋白/尿素分泌、基因表达）作为证明。
4. 技术集成与策略创新： 将GCAB墨水打印与悬浮浴打印、牺牲模板打印等多种先进生物打印策略有机结合，展示了构建复杂、厚壁、血管化组织的完整技术路线。
5. 方法的普适性潜力： 研究不仅使用了HepG2细胞球体，也成功应用于MSC球体，暗示该策略可推广至其他细胞类型，甚至未来可能整合人多能干细胞（hiPSC）来源的类器官，用于打印更大规模、具有预定微观结构和细胞组成的功能性组织。

六、 其他有价值的内容

研究在讨论部分展望了未来的研究方向：1）将GCAB生物墨水与自由形式血管网络打印相结合，构建具有复杂外部结构和内部自由形式血管网络的功能组织；2）利用中尺度牺牲打印制造的血管网络与HUVEC自组装形成的毛细血管相结合，在致密组织构建体内生成分级血管网络；3）使用由预血管化球体制成的GCAB生物墨水，进一步扩展制造高细胞密度血管化组织构建体的能力。这些展望为后续研究指明了有潜力的探索方向。