本研究由Sadeeya Khan、Yaya Rukayadi、Ahmad Haniff Jaafar和Nurul Hawa Ahmad共同完成，主要作者来自马来西亚博特拉大学（Universiti Putra Malaysia）食品科学与技术学院食品科学系以及生物科学研究所天然产物实验室。该研究于2023年11月22日在线发表于Heliyon期刊（Heliyon 9 (2023) e22771），文章标题为“从Syzygium polyanthum (Wight) Walp.合成的银纳米颗粒（sp-agnps）对选定食源性病原体的抗菌潜力”。

一、研究背景与目的

食源性疾病（foodborne diseases）主要由细菌污染引起，已成为全球公共卫生领域持续且严重的威胁。在发展中国家，食物中毒是导致死亡和感染的主要原因之一。常见的食源性病原体包括芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和大肠杆菌（Escherichia coli）等。随着抗生素的过度使用，细菌耐药性（antibiotic resistance）不断增强，传统抗生素的疗效逐渐下降，因此迫切需要开发新型抗菌剂。

植物提取物作为合成抗生素的替代品受到广泛关注，其中Syzygium polyanthum（Wight）Walp.的叶子因其药理活性而备受重视。然而，天然植物提取物的抗菌效力通常低于合成抗菌化合物。近年来，纳米技术的快速发展为解决这一问题提供了新思路。银纳米颗粒（silver nanoparticles, agnps）因其独特的物理化学性质而成为研究热点，尤其是植物介导合成的银纳米颗粒具有合成简便、成本低廉和环境友好等优点。银纳米颗粒可通过破坏细菌细胞膜、干扰细胞功能以及诱导氧化应激（oxidative stress）等多重途径发挥抗菌作用，使细菌难以产生耐药性。将agnps与植物提取物结合，有望增强抗菌效果，并为控制食源性病原体提供新的解决方案。

本研究旨在评估利用S. polyanthum叶提取物合成的银纳米颗粒（sp-agnps）对选定食源性病原体的抗菌功效，研究结果将为食源性疾病的防控和食品安全保障提供新的科学依据。

二、研究流程与实验方法

本研究主要包括植物样品采集与制备、银纳米颗粒的绿色合成、细菌菌株准备、抗菌敏感性试验以及数据分析等环节。

在植物样品采集与制备阶段，研究人员从马来西亚博特拉大学Taman Pertanian采集了S. polyanthum叶子，清洗后在50°C条件下干燥3小时，使用Panasonic MK-5087 M搅拌机粉碎。取100克粉碎后的叶片，浸泡于400毫升99.8%纯乙醇中30分钟，随后用Whatman No. 2滤纸过滤，滤液在50°C下通过旋转真空蒸发仪浓缩1–2小时，得到粗提物。

在银纳米颗粒合成阶段，参照Jain和Mehata（2017）以及Singhal等（2011）的方法，将5毫升1%的S. polyanthum叶提取物与45毫升1 mM硝酸银（AgNO₃）溶液混合，通过生物还原过程将Ag⁺还原为Ag⁰。利用紫外-可见光谱（UV–vis）分析确认银纳米颗粒的形成，结果显示在433 nm处出现特征性银吸收峰。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析表明，S. polyanthum叶提取物在合成过程中同时充当还原剂和封端剂。透射电子显微镜（TEM）成像显示sp-agnps呈球形，平均粒径为27.69 nm。

细菌菌株均来自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）。研究共纳入11种食源性病原体，包括革兰氏阳性菌（Bacillus cereus ATCC33019、Bacillus megaterium ATCC14581、Bacillus pumilus ATCC14884、Bacillus subtilis ATCC6633、Listeria monocytogenes ATCC19112、Staphylococcus aureus ATCC29737）和革兰氏阴性菌（Escherichia coli ATCC43895、Klebsiella pneumoniae ATCC13773、Pseudomonas aeruginosa ATCC9027、Proteus mirabilis ATCC21100、Salmonella typhimurium ATCC14028）。

抗菌敏感性试验包括四个部分。第一，井扩散法（well diffusion assay, WDA）：按照临床与实验室标准协会（CLSI, 2018）方案，将细菌悬液浓度调整至0.5 McFarland标准，涂布于Mueller Hinton琼脂（MHA）平板上，用7 mm玻璃巴斯德吸管打孔，每孔加入25–50 μL的0.1% sp-agnps，37°C培养24小时后测量抑菌圈直径。第二，最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）：采用96孔聚苯乙烯板微量稀释法，每孔加入100 μL sp-agnps并进行二倍稀释，37°C培养24小时后测定MIC；从各孔取10 μL培养物转接至MHA平板，再培养24小时，以无细菌生长的最低浓度作为MBC。第三，时间-杀菌试验（time-kill assay）：将sp-agnps以0× MIC、0.5× MIC、1× MIC、2× MIC和4× MIC的浓度加入含细菌的Mueller Hinton肉汤（MHB）中，在0、0.5、1、2和4小时各时间点取样，用1%无菌磷酸盐缓冲液稀释后涂布于MHA平板，37°C培养12–24小时后计数，以log₁₀ CFU/mL表示并绘制时间-杀菌曲线。

三、主要研究结果

井扩散试验结果显示，sp-agnps对所有测试的食源性病原体均表现出抑制活性。抑菌圈直径范围为10.16 ± 1.25 mm至13.16 ± 1.52 mm。其中Bacillus subtilis ATCC6633的抑菌圈最大（13.16 ± 1.52 mm），Escherichia coli ATCC43895的抑菌圈最小（10.16 ± 1.25 mm）。阴性对照DMSO未显示任何抑菌效果。这一结果表明sp-agnps具有广谱抗菌活性，其作用机制可能涉及银纳米颗粒与细菌蛋白质和酶结合，破坏细菌细胞壁和细胞膜的结构完整性，并进一步干扰DNA和RNA等关键生物分子的稳定性及细胞呼吸功能。

MIC和MBC结果显示，sp-agnps对各类食源性病原体同时具有抑菌（bacteriostatic）和杀菌（bactericidal）作用。MIC和MBC值范围均为0.008 mg/mL至0.250 mg/mL。其中，Salmonella typhimurium ATCC14028、Staphylococcus aureus ATCC29737的MIC最低（0.008 mg/mL），表明这些菌株对sp-agnps高度敏感；而Escherichia coli ATCC43895的MIC和MBC最高（分别为0.125 mg/mL和0.250 mg/mL）。敏感性差异可能与细菌细胞壁组成差异有关。纳米颗粒粒径对抑菌活性具有重要影响，粒径在1–25 nm范围内的颗粒可直接与细菌细胞相互作用，其中小于10 nm的颗粒效果更佳。

时间-杀菌试验针对多种病原体进行了详细评估。对于Bacillus cereus ATCC33019，0.5× MIC（0.008 mg/mL）暴露0.5小时后即表现出抑制作用，初始细菌数从7.14 log₁₀ CFU/mL降至4.5 log₁₀ CFU/mL；2× MIC（0.031 mg/mL）在4小时内、4× MIC（0.062 mg/mL）在2小时内实现完全杀菌。对于Bacillus megaterium ATCC14581，1× MIC（0.062 mg/mL）在4小时内使细菌数从7.21 log₁₀ CFU/mL降至5.3 log₁₀ CFU/mL，表现为抑菌作用；而2× MIC和4× MIC分别在2小时和4小时达到杀菌终点。Bacillus pumilus ATCC14884在2× MIC（0.062 mg/mL）下2小时内即被完全杀灭。Bacillus subtilis ATCC6633在2× MIC（0.124 mg/mL）2小时和4× MIC（0.250 mg/mL）4小时均达到杀菌终点，1× MIC时细菌数从7.04 log₁₀ CFU/mL降至5.15 log₁₀ CFU/mL。Listeria monocytogenes ATCC19122在4× MIC（0.124 mg/mL）下4小时内被完全杀灭；Staphylococcus aureus ATCC29737在2× MIC（0.016 mg/mL）4小时内即达完全杀菌。对于部分革兰氏阴性菌，Escherichia coli ATCC43895在4× MIC（0.500 mg/mL）下实现了超过3-log₁₀的细菌数减少，表现为强抑菌作用而非完全杀菌；Klebsiella pneumoniae ATCC13773在4× MIC（0.062 mg/mL）下4小时细菌数降至2.01 log₁₀ CFU/mL；Pseudomonas aeruginosa ATCC9027在4× MIC（0.062 mg/mL）4小时内达到杀菌效果；Salmonella typhimurium ATCC14028在2× MIC和4× MIC下4小时内细菌数减少至≥3 log₁₀ CFU/mL，呈抑菌特征；Proteus mirabilis ATCC21100在4× MIC（0.124 mg/mL）4小时内被完全杀灭。

总体而言，大多数食源性病原体在4× MIC浓度下培养4小时后被完全杀灭，仅E. coli、K. pneumoniae和S. typhimurium表现为细菌数减少至3 log₁₀ CFU/mL以上的抑菌效应。抗菌活性与暴露时间和浓度呈正相关。

四、研究结论与价值

本研究系统证实了利用S. polyanthum叶提取物绿色合成的银纳米颗粒（sp-agnps）对多种食源性病原体具有强效抗菌活性。UV–vis、FTIR和TEM表征结果确认了sp-agnps的成功合成及其基本结构特征。WDA抑菌圈范围为10.16 ± 1.25至13.16 ± 1.52 mm，MIC/MBC值低至0.008 mg/mL至0.250 mg/mL，时间-杀菌试验显示sp-agnps可使绝大多数测试菌株的细菌数量减少超过3-log₁₀ CFU/mL。

该研究的主要亮点在于：第一，采用绿色合成方法制备银纳米颗粒，利用植物提取物同时作为还原剂和封端剂，具有成本低、环境友好等优势；第二，系统评估了sp-agnps对11种食源性病原体的抑菌和杀菌活性，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，覆盖面广；第三，通过WDA、MIC、MBC和时间-杀菌试验等多种方法相互印证，全面揭示了sp-agnps的抗菌动力学特征，明确了其浓度和时间依赖性杀菌规律；第四，将sp-agnps的抗菌效果与多种其他植物提取物或纳米颗粒进行对比，显示了其在较低浓度下即可实现显著抗菌作用的优势。

本研究的科学价值在于为纳米材料与植物化学的交叉领域提供了新的实验数据，阐明了粒径、浓度和时间对抗菌效果的影响规律。其应用价值在于sp-agnps有望开发为新型天然抗菌剂，用于控制食源性病原体、预防食源性疾病和提升食品安全水平。研究同时指出，未来应进一步评估sp-agnps对哺乳动物细胞的细胞毒性（cytotoxicity），以建立全面的安全性评价体系，为实际应用提供保障。