李辉亚（Huiya Li）、刘品一（Pinyi Liu）和张冰（Bing Zhang）作为共同第一作者，袁增强（Zengqiang Yuan）及徐运（Yun Xu）等研究人员在*Genome Medicine*期刊（2023年15卷，文章编号109）上发表了一篇题为《急性缺血诱导空间和转录上不同的小胶质细胞亚群》（Acute ischemia induces spatially and transcriptionally distinct microglial subclusters）的研究。该研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）技术，深入探究了缺血性脑卒中后小胶质细胞的异质性及其潜在机制。
研究背景与目的 缺血性脑卒中的高致死率和致残率与脑缺血后发生的神经元坏死程度密切相关。在缺血核心区（ischemic core），神经元因持续缺血而逐渐死亡；而核心区周围的区域被称为缺血半暗带（ischemic penumbra），该区域的神经元尚未发生明显死亡，但如果血流恢复，该部分组织是可以被挽救的。小胶质细胞（microglia）作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，在缺血损伤后迅速响应并启动免疫炎症反应，在脑卒中后的细胞损伤中扮演着至关重要的角色。然而，小胶质细胞的具体异质性亚群及其在缺血级联反应中的复杂作用机制仍不明确。此前，研究人员常借用巨噬细胞的M1/M2极化概念来描述小胶质细胞，但这种基于体外培养得出的二分法过于简单，无法真实反映体内复杂的疾病状态。因此，本研究旨在通过结合单细胞转录组和空间转录组测序技术，首次在小鼠缺血性脑卒中模型中，鉴定与卒中相关的小胶质细胞亚群，并阐明其标志基因、功能、代谢状态以及调控它们的微环境线索。
研究流程与方法 研究团队首先构建了短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型，模拟缺血性脑卒中，并设立了假手术（sham）组作为对照。为了全面描绘缺血后脑组织的细胞图谱，研究人员在卒中后三个不同时间点（再灌注后3小时、12小时和72小时）分别收集了小鼠的缺血侧大脑半球，进行了基于液滴的单细胞RNA测序（scRNA-seq）。经过严格的质量控制，共保留了32,947个细胞进行下游分析，并通过无监督聚类和经典标记基因鉴定出15种不同的细胞类型，包括小胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和浸润性免疫细胞等。
在此基础上，研究聚焦于小胶质细胞群体，通过进一步的无监督聚类将其分为4个亚群。其中，第2亚群主要存在于假手术组，高表达稳态基因（如Tmem119, *P2ry12*），被定义为稳态小胶质细胞。第1和第3亚群是MCAO组中主要的小胶质细胞类型。为了确定这两个亚群的空间位置，研究团队进行了空间转录组学（ST）测序。他们利用载有空间条形码的载玻片捕获脑组织切片上的mRNA，并整合苏木精-伊红（H&E）染色图像，从而将基因表达信息映射回组织空间位置。通过计算scRNA-seq数据中亚群特异性标志基因在空间转录组数据中每个点（spot）上的平均表达得分，他们成功定位了这两个亚群。
为进一步验证，研究采用了RNAscope原位杂交与免疫荧光共染色技术，使用亚群特异性探针（如*Gpr65*和*Srxn1*）与经典小胶质细胞标志物TMEM119共标，在组织切片上直接观察和定量。此外，他们还通过流式细胞术、免疫荧光（如使用LGALS3和PIK3IP1抗体）以及靶向代谢组学等技术对亚群的功能和代谢特征进行了验证。在机制探索上，研究人员利用IPA（Ingenuity Pathway Analysis）软件预测驱动亚群生成的上游调节因子，并用基因集变异分析（GSVA）、SCENIC分析等生物信息学方法评估其功能通路和关键转录因子。最后，通过慢病毒介导的基因敲低（敲低*Bach1*）和体内药物干预（注射皮质酮或其拮抗剂RU486）等手段，结合TTC染色、神经行为学评分和TUNEL染色等，验证了关键调控因子的功能。
主要研究结果 通过分析，研究人员发现第3亚群的标志基因显著占据了缺血核心区，而第1亚群的标志基因则环绕在梗死病灶周围。因此，他们将这两个亚群分别命名为缺血核心相关小胶质细胞（ischemic core-associated microglia, ICAM）和缺血半暗带相关小胶质细胞（ischemic penumbra-associated microglia, IPAM），揭示了它们空间上的截然不同。RNAscope实验也验证了这点，*Srxn1*（ICAM标志物）阳性细胞在核心区富集，而*Gpr65*（IPAM标志物）阳性细胞则在半暗带分布。
在功能特征上，GSVA分析揭示了二者代谢和炎症状态的显著差异。ICAM的糖酵解（glycolysis）通路显著增强，而三羧酸循环（TCA cycle）和氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）水平相对较低；相比之下，IPAM则表现出增强的TCA循环和OXPHOS代谢特征。ICAM高表达多种促炎细胞因子（如Il1a, Il1b, *Tnf*）和趋化因子（如Ccl2, Ccl3, *Cxcl2*），表现出强烈的促炎反应，并可能驱动外周免疫细胞浸润至核心区。而IPAM虽然也有一定程度的促炎反应，但相对温和，并且其代谢特征（如增强的支链氨基酸降解、鞘脂代谢和不饱和脂肪酸合成）暗示其具有缓解炎症和神经营养的潜力。值得一提的是，研究数据明确表明，经典的M1/M2极化评分无法区分这两个亚群，且传统认为的“M2”标志物（如Arg1, *Mrc1*）主要在浸润的巨噬细胞而非小胶质细胞中表达，动摇了M1/M2二分法在此背景下的适用性。
在驱动机制上，IPA分析预测损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns, DAMPs）如脂多糖（LPS）是驱动ICAM生成的关键上游因子。实验证实，梗死核心区受损神经元释放的HMGB1（一种典型的DAMP），以及体外用LPS或神经元裂解物刺激原代小胶质细胞，均能显著上调ICAM标志基因。SCENIC分析进一步发现，转录因子BACH1是调控ICAM生成的关键，体外敲低*Bach1*基因后，LPS诱导的ICAM标志物和促炎因子表达均被抑制。相反，IPA分析发现糖皮质激素（glucocorticoids）如地塞米松是驱动IPAM生成的最强刺激因子。靶向代谢组学证实，脑卒中后缺血半暗带中的皮质酮（corticosterone）水平显著升高。体外用皮质酮刺激原代小胶质细胞可诱导IPAM标志基因的表达。体内实验进一步表明，给MCAO小鼠注射皮质酮可增加IPAM标志物的表达，并减小脑梗死体积、改善神经功能评分、减少神经元凋亡；而使用糖皮质激素受体拮抗剂RU486则得到相反结果，加重了脑损伤。
结论与价值 这项研究首次定义了两种全新的、在空间分布和转录组特征上都截然不同的卒中相关小胶质细胞亚群：ICAM和IPAM。研究结论认为，ICAM由损伤相关分子模式诱导，依赖糖酵解供能，表现出过度的促炎反应，可能加剧脑损伤；而IPAM则由半暗带富集的糖皮质激素触发，依赖三羧酸循环和氧化磷酸化供能，表现出温和的促炎反应和缓解炎症的代谢特征，具有神经保护潜力。该研究为理解缺血性脑卒中后小胶质细胞的复杂作用提供了全新的生物学基础，并指出靶向特定的小胶质细胞亚群（如抑制ICAM或促进IPAM）可能成为治疗缺血性脑卒中的新策略。
研究亮点与特色 本研究最大的亮点在于其研究策略的创新性：首次将单细胞RNA测序与空间转录组学技术相结合来分析脑卒中模型，从而实现了对细胞异质性的解析从“分子特征”到“空间位置”的跨越，精准定义了ICAM和IPAM及其微环境定位。其次，研究打破了传统M1/M2极化理论的局限，通过体内外多层次的代谢、功能和机制分析，构建了一个由微环境信号（DAMPs vs 糖皮质激素）驱动、由特定转录因子（BACH1）调控、伴随不同代谢重编程（糖酵解 vs 氧化磷酸化）并最终产生不同生物学效应（促损伤 vs 促保护）的完整小胶质细胞反应模型。此外，研究不仅发现了新的小胶质亚群标志基因，还通过靶向代谢组学、RNAscope、基因敲低和体内药理学干预等多种手段进行了严格验证，使得结论坚实有力，为脑卒中的免疫治疗提供了极具转化潜力的新靶点和新方向。