一项利用基质血管组分自组装构建血管化骨向性类器官并揭示其免疫调节功能的研究

本研究报告由解放军总医院第四医学中心骨科研究所的吴家周、何颖、钱涛和刘泽先等多名研究人员共同完成，并发表在学术期刊《Bioactive Materials》2026年第57卷（323-343页）上。

一、 研究的学术背景 本研究属于骨组织工程和再生医学领域。骨骼虽然具备再生能力，但面对大面积骨缺损、延迟愈合或不愈合骨折以及骨坏死等复杂骨科疾病时，其自愈能力往往不足。传统的骨移植疗法，如同种异体骨移植（Allogeneic Bone Grafts）存在免疫排斥和供受体匹配问题，而自体骨移植（Autologous Bone Grafts）则受限于供区可用性、手术创伤及恢复时间长等问题。因此，骨组织工程作为一种极具潜力的替代策略受到广泛关注。

三维（3D）细胞培养系统，特别是类器官（Organoid）技术，能够更好地模拟体内细胞的微环境，促进细胞间及细胞与细胞外基质（Extracellular Matrix， ECM）的相互作用，形成具有特定生理功能和组织样空间结构的三维构造，为药物筛选、疾病建模以及移植修复提供了新平台。在骨组织工程中，间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells， MSCs）是常用的种子细胞，其中脂肪来源的间充质干细胞（Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells， ADSCs）因其获取便捷、来源丰富和多向分化潜能而被视为更可行的选择。

然而，天然骨组织高度血管化，血管网络对骨骼的发育、再生和重塑至关重要。无血管的骨移植物易发生坏死。现有策略，如共培养内皮细胞与MSCs或使用促血管生长因子，存在来源不一、临床转化复杂等挑战。基质血管组分（Stromal Vascular Fraction， SVF）是获取ADSCs的初级提取物，其本身就是一个包含ADSCs、内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells， EPCs）、周细胞（Pericytes）以及多种造血细胞（如巨噬细胞）的异质性细胞群。相比经过贴壁扩增纯化的ADSCs，SVF保留了更接近体内环境的细胞组成，已被证明具有更优的成骨和成软骨分化潜力，并能用于构建血管化脂肪类器官。此外，炎症和免疫微环境在骨愈合中扮演关键角色，而SVF中天然存在的免疫细胞（如巨噬细胞）可能赋予其更仿生的功能生态位。

基于此，本研究旨在探索利用SVF细胞的自组装能力，构建具有生理相关空间结构、并兼具成骨、促血管生成和免疫调节等多重功能的类器官，并将其与纯化ADSCs形成的球体进行对比，评估其在体外和体内的功能差异及促进骨折愈合的疗效，从而为骨组织工程提供一种创新且有效的细胞来源和构建策略。

二、 研究的详细工作流程 本研究设计了一个系统性的工作流程，包含从细胞获取、类器官构建、体外功能表征到体内疗效验证等多个环节，具体如下：

1. 样本获取与伦理审批：研究从50名接受抽脂术的男性患者（平均年龄34.96岁）腹部获取脂肪组织样本。所有操作均获得解放军总医院伦理委员会批准（批号2023ky088-ks001），并获得患者知情同意。每个样本独立处理，未经混合。
2. SVF与ADSCs的分离及球体培养：脂肪组织一部分用于直接分离SVF，另一部分用于培养获取原代（P0）ADSCs。SVF通过胶原酶（Liberase™）消化、离心、过滤获得。P0 ADSCs则是将SVF细胞贴壁培养扩增后获得。通过流式细胞术对新鲜SVF和P0 ADSCs进行表型鉴定，确认其细胞组成（ADSCs、EPCs、周细胞、白细胞等）及巨噬细胞亚型（M1、M2）比例。
3. 类器官/球体的构建与分组：将SVF细胞和P0 ADSCs以相同的密度（3×10^5细胞/孔）接种到超低吸附96孔U型底板中，经过3天培养自发形成球体（此时记为第0天）。随后将球体分为四组进行培养：
   • SVF GM组：SVF球体在生长培养基（Growth Medium， GM）中继续培养，不进行诱导。
   • SVF OM组：SVF球体切换至成骨诱导培养基（Osteogenic Medium， OM）中培养。
   • ADSC GM组：ADSC球体在GM中培养。
   • ADSC OM组：ADSC球体在OM中培养。 所有体外和体内实验均使用来自同一供体的SVF和ADSCs进行配对比较，并重复至少三次（体外）或四次（体内）。
4. 形态学、活力与结构分析：
   • 宏观形态：定期观察并记录球体形成过程及大小变化。
   • 细胞活力：使用PrestoBlue试剂在培养不同时间点（-3， -2， -1， 0， 7， 14， 21天）检测细胞代谢活性。
   • 增殖与凋亡：通过免疫荧光染色检测Ki67（增殖标志）和TUNEL（凋亡标志）阳性细胞比例。
   • 组织结构：进行H&E染色观察整体结构；免疫荧光染色α-微管蛋白观察细胞骨架形态。
   • 超微结构：对培养14天的球体进行透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy， TEM）观察，分析内部细胞类型、细胞器状态及细胞外基质情况。
   • 空间组成分析：采用多重免疫荧光共定位技术，在多个时间点对球体切片进行染色，标记ADSCs（CD44）、内皮细胞（CD31）、周细胞（PDGFR）、巨噬细胞（CD68）和细胞粘附蛋白（Vinculin），定量分析各细胞类型的分布和比例变化。
5. 多功能性评估实验：
   • 多向分化诱导：将SVF和ADSC球体分别置于成骨（OM）、成软骨（Chondrogenic Medium， CM）和成脂（Adipogenic Medium， AM）诱导培养基中培养，并通过碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红S（Alizarin Red S， ARS）染色、阿尔新蓝（Alcian Blue， ABS）染色和油红O（Oil Red O， ORO）染色在7、14、21天评估分化结果。
   • 基因表达分析：在培养14天时，通过实时定量PCR（qRT-PCR）检测四组球体中成骨（RUNX2， COL1A1， OPN， OSX）、促血管生成（CD31， VEGF）、成软骨（SOX9， COL2A1）和成脂（AP2， PPAR-γ2）相关基因的mRNA表达水平。
   • 蛋白分泌谱分析：收集培养14天的四组球体在无血清培养基中孵育24小时后的条件培养基，使用定制的120靶点蛋白微阵列（RayBio）分析其分泌的炎症因子、趋化因子和生长因子等蛋白的丰度差异。
   • 免疫调节功能测试：
     • 炎症刺激：用脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）刺激SVF和ADSC球体1、3、7天，模拟炎症微环境。
     • 免疫应答分析：通过多重免疫荧光共定位检测刺激后球体中促炎因子（IL-1）、抗炎因子（IL-10）以及巨噬细胞亚型标志物（CD86， CD206， CD68）的表达和空间分布。
     • 基因表达验证：通过qRT-PCR检测LPS刺激不同时间后，球体中促炎基因（IL-1， TNF-α， IL-6）和抗炎基因（IL-10， TGF-β）的mRNA表达动态变化。
6. 蛋白质组学分析：对培养14天的四组球体进行基于质谱的蛋白质组学分析。使用数据非依赖采集-平行累积串行碎裂（DIA-PASEF）模式。通过主成分分析（Principal Component Analysis， PCA）、差异表达蛋白（Differentially Expressed Proteins， DEPs）鉴定、基因本体（Gene Ontology， GO）富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction， PPI）网络构建，从全局角度揭示SVF类器官与ADSC球体之间，以及GM与OM条件之间在蛋白质表达和功能通路上的根本差异。
7. 体内骨折修复疗效评估：
   • 动物模型建立：使用16只BALB/c裸鼠建立股骨骨折模型。随机分为五组：空白对照组（仅骨折，不植入）、假手术组（仅穿针，不骨折）、ADSC GM植入组、ADSC OM植入组、SVF GM植入组和SVF OM植入组。每组4只。将对应组别的培养14天的球体（3个/鼠）植入骨折间隙。
   • 疗效评估：术后4周，处死小鼠，取股骨进行以下分析：
     • 大体观察与X线：评估骨折愈合大体情况。
     • 显微计算机断层扫描（Micro-CT）：定量分析骨痂区域的骨体积（Bone Volume， BV）、总体积（Total Volume， TV）、骨体积分数（BV/TV）和骨矿物密度（Bone Mineral Density， BMD）。
     • 组织学与免疫组化：通过H&E染色、Masson三色染色、番红O染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-Resistant Acid Phosphatase， TRAP）染色评估新骨形成、软骨残留、胶原分布和破骨细胞活性。通过免疫荧光双染（人源和鼠源骨钙素， OCN）区分植入的供体细胞和宿主细胞在骨愈合中的贡献。
8. 数据分析：所有数据以均值±标准差表示。组间比较采用独立样本t检验或单因素/双因素方差分析（ANOVA），事后检验采用Tukey法。P值小于0.05视为有统计学差异。使用GraphPad Prism 10.0软件进行统计分析。

三、 研究的主要结果 1. SVF类器官的成功构建与结构成熟：流式分析证实SVF为高度异质的细胞群（含ADSCs、EPCs、周细胞、大量白细胞等），而P0 ADSCs则几乎纯化为ADSCs。在3D培养中，SVF细胞自组装形成的球体在培养约14天后，呈现出比ADSC球体更松散、更有组织的空间结构，含有更丰富的ECM。TEM观察进一步揭示了SVF-GM球体内部存在含有脂滴的ADSCs、线粒体丰富的代谢活跃细胞、形成广泛细胞连接的内皮样细胞（EPCs），以及外周具有吞噬溶酶体和微绒毛的细胞（推测为巨噬细胞），证实了其异质细胞组成。多重免疫荧光显示，在SVF-GM球体中，CD31阳性的内皮细胞形成了交织的管状网络，周细胞（PDGFR+）平行排列于内皮细胞旁，巨噬细胞（CD68+）主要位于球体外周。这种空间组织结构在OM诱导下被破坏，呈现出更聚集的细胞簇状排列。 2. SVF类器官具有优越的多重生物学功能： * 成骨与矿化能力：即使在不诱导的GM条件下，SVF球体也表现出可检测的ALP活性，且高于ADSC-GM组。在OM诱导下，SVF-OM组比ADSC-OM组更早（第7天）出现矿化结节，且第21天矿化沉积更显著。qRT-PCR显示，SVF-GM组的骨桥蛋白（OPN）表达显著上调，提示其可能存在独特的“免疫调节型”成骨机制。 * 促血管生成能力：免疫荧光和qRT-PCR均显示，SVF球体中内皮标志物CD31和VEGF的表达均显著高于ADSC球体。GM条件比OM条件更有利于促血管生成标志物的表达。 * 软骨和脂肪分化潜力：在相应的诱导条件下，SVF球体比ADSC球体更早、更 robust地形成软骨基质（ABS染色）和更大的脂滴（ORO染色）。有趣的是，qRT-PCR发现，成骨诱导也上调了成软骨（SOX9， COL2A1）和成脂（AP2， PPAR-γ）相关基因的表达，提示了不同分化路径间可能存在交叉对话或调控重叠。 3. SVF类器官展现出强大的免疫调节能力： * 蛋白分泌谱：与ADSC-GM相比，SVF-GM条件培养基中与细胞增殖、趋化、迁移、炎症和免疫调节相关的蛋白因子（如EGF， M-CSF， MCP-1， IL-6， TNF-RI等）水平更高，表明其具有更活跃的免疫调节和微环境塑造能力。 * 应对炎症刺激：在LPS刺激下，SVF类器官比ADSC球体表现出更强烈的促炎（IL-1）和抗炎（IL-10）反应。随着时间的推移，SVF类器官中促炎因子表达逐渐下降，而抗炎因子表达持续上升，呈现动态调节模式。空间分布上，促炎因子和M1巨噬细胞标志物（CD86）主要富集于球体外周，而抗炎因子和M2巨噬细胞标志物（CD206）则更多位于球体核心，模拟了体内组织应对损伤时的空间化免疫平衡。 4. 蛋白质组学揭示了SVF与ADSC的根本差异：PCA和聚类分析显示，SVF类器官与ADSC球体的蛋白质表达谱截然不同，GM与OM条件也会引起各自细胞类型内的显著变化。GO富集分析表明，与ADSC-GM相比，SVF-GM中上调的蛋白质富集于细胞因子信号传导、炎症调节和能量代谢通路；与SVF-OM相比，SVF-GM中上调的蛋白质则富集于ECM组织和胶原生物合成通路。这为SVF类器官优越的生物学功能和再生潜力提供了分子层面的解释。 5. SVF类器官显著促进体内骨折愈合：在裸鼠股骨骨折模型中，植入4周后，Micro-CT和组织学分析一致表明，SVF-GM和SVF-OM组均表现出比ADSC组和空白组更佳的骨折愈合效果，骨折线模糊，骨痂形成明显。值得注意的是，SVF-GM组（未经过体外成骨诱导）在促进骨折愈合、加速骨痂重塑方面表现最为突出：其形成的骨痂体积更小但更致密，骨体积分数（BV/TV）和骨矿物密度（BMD）数值最高（尽管与SVF-OM组无显著差异），TRAP染色显示的破骨细胞数量最少，Masson染色和番红O染色显示更成熟的骨组织和更少的残留软骨。免疫荧光证实了植入的供体细胞（人源OCN阳性）对新生骨组织的贡献，且SVF组贡献更显著。

四、 研究的结论与价值 本研究成功利用脂肪来源的基质血管组分（SVF），通过简单的自组装方法，构建了具有复杂空间组织结构、并同时具备成骨、促血管生成和免疫调节三重功能的类器官。研究结论如下：

1. SVF是构建多功能骨向性类器官的理想细胞源：相比纯化扩增的ADSCs，SVF因其固有的细胞异质性，能够在3D培养中自发形成更接近天然组织的空间结构（含血管网络和免疫细胞），并展现出更优越的成骨、成软骨、成脂和促血管生成潜能。
2. SVF类器官具备仿生的免疫调节功能：其内含的免疫细胞（尤其是巨噬细胞）及分泌的丰富细胞因子网络，使其能够对外部炎症刺激做出动态、空间化的应答，模拟体内免疫微环境的平衡过程，这可能对其在损伤部位的存活、整合及促进组织修复至关重要。
3. 体外成骨诱导并非体内疗效的必要条件：本研究发现，未经体外成骨诱导的SVF类器官（SVF-GM）在植入体内后，其促进骨折愈合和骨痂成熟的效果甚至优于或等同于经过诱导的组别。这表明SVF类器官在体内的“智能化”表现——能够响应宿主骨折微环境，自发启动并协调成骨、血管生成和免疫调节过程，无需复杂的体外预编程。

本研究的科学价值在于： * 提供了骨组织工程的新策略：将SVF直接用作多功能“类器官单元”，避免了复杂的细胞分离、纯化、扩增和再组合步骤，简化了流程。 * 强调了细胞组成异质性的重要性：研究证明了保留组织原位的细胞群落（包括支持细胞和免疫细胞）对于构建具有生理功能和应答能力的类器官至关重要。 * 深化了对骨修复中“血管-成骨-免疫”耦合机制的理解：研究结果揭示了SVF类器官如何内在整合这三方面功能，并提供了其分子和细胞基础。 * 挑战了传统观念：研究结果表明，对于某些具备多细胞协同潜能的细胞源，复杂的体外诱导可能并非最佳选择，有时简单的培养条件反而能保留其在体内环境中的最大适应和修复潜能。

本研究的应用价值在于： * 为临床骨缺损修复提供了潜在的新疗法：SVF可从患者自身脂肪中快速获取，结合其3D类器官构建技术，有望发展成为一种高效、个性化、且易于临床转化的“活性骨移植物”。 * 为其他组织器官的类器官构建提供借鉴：这种利用组织原代细胞群自组装构建多功能类器官的思路，可推广至其他需要血管化和免疫调节功能的组织工程领域。

五、 研究的亮点 1. 创新性的细胞源选择与构建策略：首次系统性地将脂肪SVF直接用于构建具有成骨、血管生成和免疫调节三重功能的类器官，并与纯化的ADSCs进行了全面对比。 2. 综合且深入的表征体系：研究采用了从形态、超微结构、空间组成、分子表达（基因、蛋白、分泌因子）、到体内功能验证的多层次、多维度分析手段，全面揭示了SVF类器官的特性。 3. 对免疫调节功能的重点关注与机制探索：不仅证实了SVF类器官的免疫调节能力，还通过LPS刺激实验和空间分布分析，揭示了其动态、双向、空间化的免疫应答模式，这是以往骨组织工程研究中常被忽略的方面。 4