该研究发表于期刊*Autophagy*，并于2025年2月修订和接受。通讯作者包括来自南京医科大学第一附属医院神经外科的曹红禄、涂义明和嵇晶。
二、 研究的学术背景 该研究属于神经损伤与修复领域，聚焦于创伤性脑损伤后神经元的程序性死亡机制及潜在的治疗靶点。创伤性脑损伤是全球范围内高死亡率和致残率的常见神经系统疾病。神经元功能障碍和死亡是影响其预后的关键因素。以往研究已发现神经元在损伤后会发生凋亡、坏死性凋亡和焦亡等多种细胞死亡形式，但患者不良的预后提示可能还有未被阐明的死亡机制参与其中。
“泛凋亡”是近年来被识别的一种新型程序性细胞死亡模式，它强调细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡三种死亡模式之间的相互作用与协调。由于这三种死亡模式均在TBI后出现，抑制神经元泛凋亡具有巨大的治疗潜力。另一方面，线粒体自噬是清除功能失调线粒体、维持细胞稳态的关键过程，其功能障碍与多种神经系统疾病相关。然而，TBI后神经元中泛凋亡的调控机制，以及其与线粒体自噬之间的潜在联系尚不清楚。PSMD14作为26S蛋白酶体的一个亚基，属于去泛素化酶家族，但在神经元中的功能研究较少。
本研究旨在阐明PSMD14在TBI后神经元死亡中的作用及其具体分子机制，探索其是否通过调控线粒体自噬来抑制泛凋亡，从而改善神经功能预后，并为TBI寻找新的潜在治疗策略。
三、 详细的研究工作流程 本研究采用了从临床样本到动物模型、再到体外细胞模型的系统化研究策略，结合了多种组学、分子生物学、细胞生物学及行为学分析技术，层层递进地揭示了PSMD14的功能与机制。
程序一：筛选与验证PSMD14在脑损伤后的表达变化 * 研究对象： 人脑组织样本（10例TBI，5例对照）、小鼠CCI模型（造模后不同时间点）、原代皮层神经元（体外牵拉损伤模型）。 * 样本量： 蛋白质组学分析中，CCI 6小时组与假手术组各8只小鼠；其他定量实验中，通常为每组3-8个独立样本或重复。 * 处理与实验： 1. 蛋白质组学筛选： 使用无标记液相色谱-质谱联用技术分析CCI模型小鼠损伤皮层与假手术组的蛋白质表达差异。在984个差异表达蛋白中，与98个已知的去泛素化酶取交集，发现PSMD14是其中之一。 2. 表达验证： 通过Western Blot、qPCR和免疫组化技术，在TBI患者样本、CCI小鼠模型（12h， 24h， 48h）以及体外牵拉损伤的原代神经元中，证实PSMD14在mRNA和蛋白水平均显著上调。 3. 细胞定位： 通过数据库预测和免疫荧光共定位，确认PSMD14主要在小鼠神经元中表达，并在损伤后神经元内表达增加。 * 数据与分析： 蛋白质组学数据通过MaxQuant软件处理，并进行统计学差异分析。其他定量数据通过t检验或ANOVA进行统计分析。
程序二：探究PSMD14在神经元泛凋亡中的作用 * 研究对象： 体外培养的原代皮层神经元。 * 处理与实验： 1. 功能丧失与获得： 使用慢病毒介导的短发夹RNA敲低PSMD14，或使用慢病毒过表达PSMD14。 2. 细胞活力与毒性： 利用CCK-8法和乳酸脱氢酶释放实验评估神经元活性和细胞毒性。 3. 死亡通路鉴定： 在敲低PSMD14的神经元中，分别使用针对凋亡、坏死性凋亡、焦亡、铁死亡和自噬的特异性抑制剂，观察哪种抑制剂能挽救细胞活力。 4. 分子标志物检测： 通过Western Blot检测泛凋亡相关标志物（如cleaved Caspase-8/3（凋亡）、磷酸化MLKL、RIPK1、RIPK3（坏死性凋亡）、cleaved Caspase-1和GSDMD（焦亡））的水平变化。 5. 细胞染色： 使用TUNEL染色、碘化丙啶染色和EthD-III染色分别标记凋亡、坏死性凋亡和焦亡的细胞。 * 数据与分析： 结合多种抑制剂挽救实验的结果和多种死亡标志物的共上调，综合判定PSMD14敲低诱导的是一种包含凋亡、坏死性凋亡和焦亡特征的联合死亡程序，即泛凋亡。反之，PSMD14过表达则能抑制牵拉诱导的泛凋亡。
程序三：在体验证PSMD14对神经功能预后的影响 * 研究对象： 条件性神经元特异性PSMD14敲除小鼠、以及通过腺相关病毒在神经元中过表达PSMD14的C57BL/6J小鼠。 * 样本量： 行为学测试中，每组通常为8只小鼠。 * 处理与实验： 1. 基因工程小鼠： 使用Nestin-Cre工具鼠与PSMD14-floxed小鼠交配，获得神经元特异性敲除PSMD14的小鼠。 2. 病毒介导的过表达： 向小鼠海马区注射神经元特异性启动子驱动的AAV-PSMD14病毒。 3. 神经功能评估： * 运动功能： 在CCI后第2天进行转棒实验，评估小鼠的运动协调和耐力。 * 学习记忆： 在CCI后第14天开始进行莫里斯水迷宫测试，包括3天的可见平台训练和5天的隐藏平台训练，记录逃避潜伏期、游泳距离和游泳速度。 4. 分子验证： 取脑组织进行Western Blot，验证PSMD14敲除或过表达效率，以及泛凋亡标志物的变化。 * 数据与分析： 行为学数据通过ANOVA分析组间差异。结果证实PSMD14敲除加剧了CCI后的神经功能缺损，而过表达PSMD14则能显著改善运动和学习记忆能力。
程序四：探究PSMD14调控泛凋亡的上游机制：活性氧与线粒体自噬 * 研究对象： 体外培养的原代皮层神经元。 * 处理与实验： 1. 活性氧水平检测： 使用DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧水平。 2. 氧化还原稳态评估： 检测谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比值以及超氧化物歧化酶活性。 3. 线粒体功能评估： 使用JC-1探针或TMRE染色检测线粒体膜电位；通过Western Blot检测线粒体质量相关蛋白（如VDAC1， Timm23， HSP60）的水平。 4. 线粒体自噬评估： * Western Blot： 检测线粒体自噬标志物，如LC3-II转换、p62降解、以及PINK1/Parkin通路关键蛋白（磷酸化Parkin S65， 磷酸化泛素）的水平。 * 免疫荧光共定位： 使用MitoTracker（标记线粒体）和LysoTracker（标记溶酶体）共染色，通过共定位程度评估线粒体被溶酶体清除的情况。 * pH敏感荧光蛋白： 转染Mito-Keima腺病毒，利用其激发光谱随pH变化的特性，直接观察线粒体被递送至酸性溶酶体的过程。 5. 功能挽救实验： 使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸中和活性氧，或使用氯喹抑制自噬体-溶酶体融合，观察是否能逆转PSMD14调控的活性氧水平、线粒体自噬和细胞死亡。 * 数据与分析： 结果表明PSMD14敲低导致活性氧积累、线粒体膜电位下降、功能失调线粒体增多、线粒体自噬被抑制；而过表达则相反。N-乙酰半胱氨酸能挽救PSMD14敲低诱导的泛凋亡，氯喹能阻断PSMD14过表达带来的保护作用，证明PSMD14通过激活线粒体自噬来降低活性氧，从而抑制泛凋亡。
程序五：阐明PSMD14激活线粒体自噬的具体分子通路：PKM2介导的PINK1磷酸化 * 研究对象： 体外培养的原代皮层神经元、HEK293T细胞。 * 处理与实验： 1. 寻找PSMD14下游靶点： 通过免疫共沉淀结合质谱分析，筛选与PSMD14相互作用的磷酸化酶，PKM2得分最高。 2. 蛋白互作验证： 通过免疫共沉淀和GST pull-down实验，证实PSMD14与PKM2存在直接相互作用。 3. PKM2对PINK1磷酸化的影响： 敲低或过表达PKM2（及其激酶失活突变体K367M），检测PINK1蛋白水平及其在Thr257和Ser228位点的磷酸化水平。 4. PSMD14对PKM2的调控： 检测PSMD14对PKM2 mRNA、蛋白稳定性（环己酰亚胺追踪实验）和泛素化水平的影响。通过体外泛素化实验和特定连接类型（Lys48， Lys63）泛素链的分析，确定PSMD14的去泛素化作用类型。 5. 功能依赖实验： 在敲低PKM2或Parkin的背景下，过表达PSMD14，观察其是否还能促进线粒体自噬、减少活性氧、提高细胞活力。 * 数据与分析： 机制链条被清晰阐明：PSMD14作为去泛素化酶，通过移除PKM2上的Lys48连接的多聚泛素链，稳定PKM2蛋白水平。稳定的PKM2进而磷酸化PINK1蛋白的Thr257位点（而非Ser228位点），从而激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬通路。PKM2或Parkin的缺失会废除PSMD14的神经保护作用。
程序六：探究TBI后PSMD14上调的表观遗传学机制：组蛋白乳酸化修饰 * 研究对象： 体外培养的原代皮层神经元、CCI小鼠模型、人脑组织样本。 * 处理与实验： 1. 组蛋白乳酸化修饰检测： 使用特异性抗体，通过Western Blot检测损伤后神经元整体乳酸化及多个组蛋白乳酸化位点的动态变化，发现H3K18la显著上调。 2. 染色质免疫共沉淀-qPCR： 验证H3K18la在PSMD14基因启动子区的富集情况，以及牵拉损伤对此富集的影响。 3. 调控因子验证： 使用乳酸脱氢酶A抑制剂草氨酸盐降低乳酸水平，或外源性添加乳酸，或过表达组蛋白乳酸化“写入器”EP300，观察对PSMD14表达的影响。使用EP300抑制剂A-485验证其必要性。 4. 临床相关性分析： 在TBI患者样本中，分析PSMD14蛋白水平与整体乳酸化水平及H3K18la水平的相关性。 5. 乳酸治疗的疗效验证： 在体外神经元牵拉模型和CCI小鼠模型中，给予乳酸处理，评估其对PSMD14/PKM2表达、线粒体自噬、活性氧、泛凋亡以及神经行为学结局的影响。 * 数据与分析： 结果表明，TBI后神经元内H3K18la修饰增加，直接促进了PSMD14的转录上调。临床样本中二者呈正相关。乳酸治疗能够模拟这一过程，通过提高H3K18la和PSMD14水平，发挥神经保护作用，改善行为学预后。
四、 主要研究结果 1. PSMD14在TBI后神经元中特异性上调： 蛋白质组学、多个物种（人、鼠）和多个层次（组织、细胞）的实验均证实，PSMD14在脑损伤后的神经元中表达显著升高，且呈时间依赖性。 2. PSMD14抑制神经元泛凋亡： 功能实验表明，敲低PSMD14会诱导神经元发生同时具备凋亡、坏死性凋亡和焦亡特征的泛凋亡，并降低细胞活力；而过表达PSMD14则能抵抗牵拉损伤诱导的泛凋亡和细胞死亡。 3. PSMD14改善TBI后的神经功能缺损： 在体实验证明，神经元特异性敲除PSMD14会加重CCI小鼠的运动协调障碍和空间学习记忆缺陷；而病毒介导的PSMD14过表达则能显著改善这些神经行为学症状。 4. PSMD14通过激活线粒体自噬来清除活性氧： 机制上，PSMD14敲低导致活性氧爆发、线粒体膜电位丧失、功能失调线粒体累积，并抑制了Parkin介导的线粒体自噬。抗氧化剂能挽救PSMD14缺失导致的泛凋亡，自噬抑制剂能阻断PSMD14过表达的保护作用，表明PSMD14通过促进线粒体自噬来维持氧化还原稳态。 5. PSMD14通过去泛素化并稳定PKM2来磷酸化激活PINK1： 深入的分子机制揭示，PSMD14作为去泛素化酶，直接与PKM2结合，移除其Lys48连接的泛素链，防止其被蛋白酶体降解，从而稳定PKM2蛋白。PKM2进而特异性磷酸化线粒体自噬关键激酶PINK1的Thr257位点，激活下游通路。PKM2激酶活性的丧失会废除PSMD14的所有保护效应。 6. 组蛋白H3K18乳酸化驱动了TBI后PSMD14的上调： 上游表观遗传调控机制显示，损伤后神经元内乳酸水平变化导致组蛋白H3第18位赖氨酸发生乳酸化修饰，该修饰富集于PSMD14启动子区，直接驱动其转录激活。乳酸治疗可通过该途径模拟内源性保护，改善预后。 7. PSMD14的神经保护作用依赖于PKM2和Parkin： 在PKM2或Parkin被敲低的模型中，PSMD14过表达无法再发挥其促进线粒体自噬、减少活性氧、抑制泛凋亡以及改善神经功能的作用，证实了该通路的必要性和完整性。
五、 结论与意义 本研究系统揭示了TBI后神经元内一条从表观遗传调控到细胞死亡保护的崭新信号轴：损伤导致的代谢变化（乳酸积累）→ 组蛋白H3K18乳酸化修饰 → PSMD14转录上调 → PSMD14去泛素化并稳定PKM2 → PKM2磷酸化PINK1（Thr257）→ 激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬 → 清除功能失调线粒体、减少活性氧生成 → 抑制神经元泛凋亡 → 改善神经功能预后。
科学价值： 1. 提出了神经元“泛凋亡”这一新概念在TBI中的重要作用，并阐明了其一条完整的分子调控通路。 2. 首次将组蛋白乳酸化这一新兴表观遗传修饰与TBI后神经元的适应性保护反应联系起来，拓展了代谢物调控基因表达在神经损伤领域的认知。 3. 发现了PSMD14在神经系统中的全新功能，即通过非蛋白酶体依赖的方式，以去泛素化酶的身份稳定PKM2，跨界调控线粒体质量控制。 4. 阐明了PKM2在神经元中不依赖于其糖酵解功能的新角色——作为磷酸化酶直接激活PINK1，深化了对PINK1激活机制的理解。
应用价值： 1. 提供了潜在的干预靶点： PSMD14、PKM2、PINK1的Thr257磷酸化位点以及组蛋白乳酸化修饰（如H3K18la）均可作为开发TBI神经保护药物的新靶点。 2. 提出了新的治疗策略： 外源性乳酸或小分子药物（如组蛋白乳酸化“写入器”激动剂）可能通过模拟内源性保护通路，成为改善TBI预后的可行策略。 3. PSMD14本身有潜力成为评估TBI严重程度或预后的生物标志物。
六、 研究亮点 1. 研究范式系统完整： 从临床现象（TBI样本）出发，利用动物模型和细胞模型，结合组学筛选、分子互作、功能获得/丧失、在体行为验证等多种手段，构建了一条逻辑严密、证据链完整的信号通路。 2. 机制研究层层深入： 不仅发现了PSMD14的功能，还逐级解析了其下游（PKM2-PINK1-线粒体自噬-活性氧-泛凋亡）和上游（H3K18la）的调控机制，形成了闭环。 3. 跨领域概念整合创新： 创造性地将“泛凋亡”、“组蛋白乳酸化”、“线粒体自噬”和“去泛素化修饰”这几个分属细胞死亡、表观遗传、细胞器质量和蛋白质翻译后修饰的热点领域交叉融合，产生了新颖的学术见解。 4. 技术方法全面先进： 运用了无标记蛋白质组学、免疫共沉淀-质谱联用、pH敏感荧光蛋白实时监测线粒体自噬、神经元特异性条件性敲除小鼠、脑区特异性AAV病毒递送等多种前沿技术。 5. 转化医学意义明确： 研究终点明确指向改善神经功能预后，并且通过乳酸治疗实验初步验证了临床转化的可行性，体现了从基础到临床的研究思路。