本报告基于Malte Borggrewe等人于2021年发表在《Acta Neuropathologica Communications》上的题为“VISTA regulates microglia homeostasis and myelin phagocytosis, and is associated with MS lesion pathology”的研究论文。该研究是一项聚焦于中枢神经系统免疫调节的原创性基础研究。
一、 研究团队与发表信息
本研究的主要作者包括Malte Borggrewe（第一作者）、Susanne M. Kooistra、Evelyn M. Wesseling等，通讯作者为Jon D. Laman。研究团队主要来自荷兰格罗宁根大学医学中心分子神经生物学系以及荷兰北部多发性硬化症中心，合作者还包括美国达特茅斯大学盖泽尔医学院和耶鲁大学医学院的研究人员。该研究成果于2021年发表于专业期刊《Acta Neuropathologica Communications》上，为开放获取文章。
二、 研究背景与目标
本研究隶属于神经免疫学与神经病理学交叉领域。其背景基于对免疫检查点分子在神经系统中功能的日益关注。VISTA（V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation，含V型免疫球蛋白域的T细胞活化抑制因子）是一种负向免疫检查点调节分子（Negative checkpoint regulator， NCR），主要在髓系细胞和T细胞上表达，在抑制T细胞活化、调节细胞因子产生和吞噬作用（如胞葬作用， efferocytosis）中发挥功能。近期研究发现，VISTA在中枢神经系统（Central nervous system， CNS）中主要由小胶质细胞（microglia）表达，且在神经炎症（如实验性自身免疫性脑脊髓炎， EAE）模型中表达下降。然而，VISTA在小胶质细胞中的具体功能及其在多发性硬化症（Multiple sclerosis， MS）病变中的作用尚属未知。
本研究的核心目标包括：1）详细刻画VISTA在不同阶段MS患者脑组织病变中的表达模式；2）通过构建条件性敲除小鼠模型，系统探究VISTA在小胶质细胞稳态和神经炎症（以脂多糖LPS和EAE为模型）中的功能；3）在体外验证VISTA对小胶质细胞吞噬功能，特别是髓鞘吞噬的影响。
三、 详细研究流程与方法
本研究设计严谨，整合了人类组织学分析、转基因小鼠模型、体内外功能实验以及高通量转录组测序等多种技术手段。
流程一：VISTA在MS病变中的表达分析 * 研究对象： 来自荷兰脑库的14例MS患者死后脑组织样本。样本涵盖了正常表现白质（NAWM）、正常表现灰质（NAGM）以及6种不同阶段的MS病变：活动前期病变（preactive）、活动期病变（active）、慢性活动期病变的中央区（center）和边缘区（rim）、非活动期病变（inactive）、再髓鞘化病变（remyelinated）和皮质病变（cortical）。每种病变类型分析5例患者样本。 * 处理方法与实验： 对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织进行免疫组织化学染色。使用抗VISTA、抗PLP（用于评估脱髓鞘程度）、抗HLA-DR（用于评估炎症水平）以及小胶质细胞标记物（IBA1, TMEM119, CD68）等抗体进行染色。通过数字病理扫描系统获取图像，并使用图像分析软件定量计算VISTA等蛋白的阳性染色面积，以评估其在不同病变中的表达水平变化。
流程二：构建和研究小胶质细胞特异性VISTA条件敲除小鼠 * 研究对象： 实验小鼠。通过将VISTA-floxed小鼠（Vista^loxp/loxp）与表达他莫昔芬诱导型Cre重组酶的小鼠（Cx3cr1^CreERT2/wt）杂交，获得基因型为Cx3cr1^CreERT2/wt Vista^loxp/loxp的条件性敲除小鼠。通过口服他莫昔芬，诱导在表达CX3CR1的细胞（主要为小胶质细胞和部分单核/巨噬细胞）中特异性敲除VISTA基因，实验组为VISTA敲除（KO）组；口服玉米油的同窝小鼠作为野生型（WT）对照组。 * 体内炎症模型建立： 1. LPS急性炎症模型： 对成年条件性敲除小鼠腹腔注射LPS（脂多糖）或PBS（对照），3小时后处死，分离全脑小胶质细胞进行分析。 2. EAE慢性神经炎症模型： 对雌性条件性敲除小鼠使用MOG35-55肽段免疫，诱导EAE（实验性自身免疫性脑脊髓炎， MS的动物模型）。在小鼠出现症状的不同阶段（评分1：疾病早期；评分4：疾病高峰期；慢性期）处死，分离脊髓小胶质细胞进行分析。未免疫的小鼠作为对照组。 * 分析方法： 1. 小胶质细胞形态学分析： 对小鼠脑组织进行Iba1免疫染色，使用高分辨率扫描仪获取图像。研究团队开发了一个专门的分析工具（引用自[27, 51]），对随机选取的至少20个小胶质细胞进行27种形态学参数的全自动分析，包括Sholl分析（评估细胞分支复杂度）和基于主成分分析（PCA）的无监督聚类，以识别不同形态的细胞亚群。 2. 转录组学分析： 通过流式细胞分选术（FACS）从大脑（LPS实验）或脊髓（EAE实验）中分选出高纯度的小胶质细胞。提取RNA后进行高通量RNA测序。数据分析包括：差异基因表达分析（使用DESeq2 R包）、加权基因共表达网络分析（WGCNA，用于识别共表达的基因模块）、以及使用EnrichR对差异基因进行基因本体（GO）生物过程、分子特征数据库（MSigDB）和转录因子靶点的富集分析。 3. 基因敲除效率验证： 通过流式细胞术检测小胶质细胞表面VISTA蛋白表达，以及通过RT-qPCR检测VISTA mRNA表达，确认敲除的效率和稳定性（验证至诱导后6个月）。
流程三：体外原代小胶质细胞功能验证 * 研究对象： 从新生（P0-3）条件性敲除小鼠大脑分离培养的原代小胶质细胞。 * 处理方法与实验： 1. VISTA敲除与刺激： 在培养体系中加入4-羟基他莫昔芬或乙醇（对照）处理，诱导VISTA敲除。随后用多种刺激剂处理细胞，包括TLR配体（LPS, Pam3CSK4， Poly I:C）、促炎细胞因子（IL-1β， TNF-α）、抗炎细胞因子（IL-4， IL-10， TGF-β）以及小鼠来源的髓鞘，通过RT-qPCR检测VISTA及其它基因的表达变化。 2. 吞噬功能实验（核心功能验证）： 建立了一套基于活细胞成像的定量吞噬检测体系。将待吞噬的底物（早期凋亡的Jurkat细胞、大肠杆菌生物颗粒、从小鼠脑中分离纯化的髓鞘）用pHrodo Red荧光染料标记。该染料在吞噬体酸性环境中荧光急剧增强，从而特异性地指示被吞噬的底物。将标记好的底物与VISTA敲除或对照的小胶质细胞共培养，使用Incucyte活细胞分析系统每15分钟自动拍摄并定量荧光信号，持续12小时，从而动态、定量地评估小胶质细胞对不同底物的吞噬能力。实验设置了细胞松弛素D（吞噬抑制剂）处理组作为阴性对照。
四、 主要研究结果及其逻辑关联
结果一：VISTA在MS病变中差异表达，并在炎症刺激下表达下调。 在人类MS脑组织中，VISTA的表达具有病变阶段特异性。与正常表现区域相比，VISTA表达在活动前期、活动期以及慢性活动期病变的边缘区（这些区域炎症活跃）上调；而在非活动期病变和慢性活动期病变的中央区（炎症消退或缺乏）下调。再髓鞘化和皮质病变中变化不显著。VISTA表达与经典小胶质细胞标记物IBA1、TMEM119的相关性较强，而与炎症标记物HLA-DR、CD68的相关性较弱，提示其表达主要关联于小胶质细胞本身的状态。在动物模型中，EAE小鼠脊髓小胶质细胞表面VISTA蛋白在所有疾病阶段均下调；体外实验中，TLR配体（LPS等）和促炎因子TNF-α刺激能显著降低小胶质细胞VISTA的mRNA表达。 * 逻辑与贡献： 此结果将VISTA确立为一个在神经炎症环境中受到动态调控的分子，其表达模式与MS病变的炎症状态紧密相关，为后续研究其功能提供了病理学关联依据。
结果二：VISTA敲除扰乱稳态下小胶质细胞的形态和转录谱，但不影响其对LPS的急性反应。 在未经炎症刺激（PBS处理）的小鼠中，与WT相比，VISTA KO小胶质细胞表现出分支减少、形态更偏向阿米巴样的“活化”表型。转录组分析显示，稳态下VISTA KO脑小胶质细胞有286个基因差异表达。其中上调的基因富集于免疫激活（如JAK-STAT、TNF、干扰素γ信号）和细胞周期（E2F靶标、G2-M检查点）相关通路；下调的基因则与细胞黏附、自噬等过程相关。同时，KO细胞中稳态小胶质细胞标志基因（如Cx3cr1， Tmem119， P2ry12）表达降低，而与增殖、干扰素反应及神经退行性疾病相关的小胶质细胞（DAM）基因集表达升高。然而，在腹腔注射LPS后，VISTA KO与WT小胶质细胞的转录反应高度相似，两者差异基因数量为零。WGCNA分析也显示，基因表达模块主要与LPS处理相关，而与基因型（KO/WT）强相关的模块较少。 * 逻辑与贡献： 这一系列结果清晰地表明，VISTA在维持小胶质细胞的稳态表型中扮演关键角色，其缺失会导致小胶质细胞在基线状态就趋向“预激活”。但是，VISTA并不调控小胶质细胞对LPS这种强烈急性炎症刺激的应答能力。结果提示VISTA的功能可能更侧重于防止小胶质细胞在非炎症状态下的过度活化，而非抑制其固有的免疫反应程序。
结果三：VISTA敲除不影响EAE疾病进程，但导致脊髓小胶质细胞基线转录谱改变。 在EAE模型中，VISTA KO小鼠与WT小鼠的疾病发病时间、严重程度（临床评分）和进程均无显著差异。对脊髓小胶质细胞的转录组分析发现，与大脑类似，绝大多数差异表达基因出现在未免疫的对照小鼠中，而在EAE的各个阶段，KO与WT之间的差异基因很少。然而，对基因表达动态的深入分析（四象限图）揭示，由于VISTA KO脊髓小胶质细胞在基线时就已存在独特的转录谱（富集细胞周期和免疫相关基因），它们在EAE过程中上调和下调的基因集合与WT细胞有所不同。换句话说，KO细胞在EAE中看似“独特”的反应，实际上是其基线状态差异的延伸，而非对EAE刺激产生了不同的应答程序。 * 逻辑与贡献： 此结果进一步强化了“VISTA调控小胶质细胞稳态”的结论，并扩展到脊髓这一MS/EAE的靶器官。同时，它明确了小胶质细胞特异性缺失VISTA不足以改变EAE的整体病程，这与以往全身性VISTA敲除会加剧EAE的报道形成对比，提示外周免疫细胞上的VISTA可能在EAE发病中起更主要的作用。
结果四：VISTA特异性调控小胶质细胞对髓鞘的吞噬，而不影响对其他颗粒的吞噬。 体外吞噬实验获得了本研究最特异性的功能发现：VISTA敲除显著降低了原代小胶质细胞对髓鞘的吞噬（约降低25%），但对大肠杆菌颗粒和早期凋亡的Jurkat细胞的吞噬能力没有影响。LPS预处理会普遍抑制髓鞘吞噬，但在LPS存在下，VISTA KO与WT之间的吞噬差异消失。 * 逻辑与贡献： 这一结果至关重要。它首次揭示了VISTA在小胶质细胞中的一项特异性功能——调节对中枢神经系统特有成分“髓鞘”的清除。这与其在巨噬细胞中主要调控凋亡细胞清除（胞葬作用）的功能形成了鲜明对比，提示了VISTA功能的细胞类型和底物特异性。此发现直接连接了VISTA与MS的核心病理过程——脱髓鞘与髓鞘清除。
五、 研究结论与价值
本研究得出结论：VISTA是中枢神经系统小胶质细胞稳态的重要调节因子。它抑制小胶质细胞在静息状态下的过度活化和增殖倾向，维持其稳态表型。在功能上，VISTA特异性地参与调节小胶质细胞对髓鞘的吞噬过程。在MS病变中，VISTA的表达呈现动态变化，可能反映了小胶质细胞在疾病不同阶段的功能状态。尽管小胶质细胞缺失VISTA本身不改变EAE的疾病进程，但它可能通过影响髓鞘清除和小胶质细胞稳态，间接参与MS的病理生理。
其科学价值在于：1）首次系统阐明了免疫检查点分子VISTA在小胶质细胞中的生物学功能，填补了该领域的知识空白；2）揭示了VISTA功能具有细胞类型和底物特异性，拓展了对免疫检查点分子复杂性的认识；3）将基础研究发现与人类疾病（MS）的病理特征直接关联，为理解MS病变异质性提供了新的分子视角。应用价值在于：鉴于VISTA可被激动剂或拮抗剂抗体靶向，本研究为开发针对VISTA的神经免疫疾病治疗策略（例如，在MS中通过调节VISTA来影响髓鞘清除和修复）提供了重要的 preclinical 理论依据和潜在的生物标志物（病变中的表达模式）。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
论文最后对VISTA在MS中可能扮演的“双重角色”进行了富有洞见的讨论：一方面，在炎症活跃的病变中VISTA表达升高，可能通过抑制浸润T细胞和维持小胶质细胞稳态来限制损伤；另一方面，其表达下降可能影响髓鞘碎片的清除，而髓鞘清除既能通过释放抗炎介质促进修复，也可能通过呈递抗原加剧免疫反应。这种复杂性提示，靶向VISTA的治疗需要精细考量其在疾病特定阶段和特定细胞类型中的作用。此外，研究确认了VISTA条件敲除模型的稳定性和有效性，为后续更长期或更复杂疾病模型中的研究奠定了基础。补充材料中提供了详尽的数据，包括患者信息、形态学参数、基因列表和测序结果，体现了研究的透明度和可重复性。