本研究由Aja Harding、Elizabeth Cortez-Toledo、Nataly L. Magner、Julie R. Beegle、Dane P. Coleal-Bergum、Dake Hao、Aijun Wang、Jan A. Nolta及Ping Zhou等人完成，主要作者隶属于加州大学戴维斯分校医学中心（University of California Davis Medical Center）的内科干细胞项目与外科部门，以及洪堡州立大学（Humboldt State University）生物科学系。该研究发表于《Stem Cells》期刊，2017年第35卷第4期，页码909至919。

该研究属于干细胞生物学与再生医学领域，聚焦于从多能干细胞（pluripotent stem cells, PSCs）高效诱导分化出内皮细胞（endothelial cells, ECs）的方法及其分子机制。血管疾病影响全球数以百万计的人群，严重者可导致截肢或致死性卒中。在生理条件下，血管新生（vasculogenesis）和血管生成（angiogenesis）是形成新血管的两个主要过程，但在患有卒中、糖尿病或阿尔茨海默病等疾病的个体中，这些过程常受损。内皮细胞衬覆于所有血管腔面，对血管通透性、血管生成和组织再生起着关键调控作用。人多能干细胞，包括人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）和人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs），因具有自我更新能力并能分化为体内几乎所有细胞类型，因而成为制备ECs的理想来源。然而，以往从多能干细胞分化得到的EC群体纯度往往不足，常需借助细胞分选（cell sorting）或磁珠分离（magnetic affinity separation）才能获得较纯的ECs。本研究旨在建立一种无需分选即可高效获得高纯度ECs的方法，同时阐明控制内皮命运定向的关键信号通路。

在实验流程方面，研究采用三阶段诱导方案。第一阶段，将hiPSC系IMR-90-4和hESC系H9以细胞小团块形式接种于基质胶（Matrigel）包被的培养板上，使用小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, MEFs）条件培养基并添加10 ng/ml FGF2培养1天。随后转入StemDiff APEL培养基，加入6 μM的GSK3抑制剂CHIR99021处理2天以激活Wnt信号通路，从而诱导中胚层（mesoderm）分化。第二阶段，将所得中胚层细胞在含有25 ng/ml BMP4、10 ng/ml FGF2和50 ng/ml VEGF的StemDiff APEL培养基中继续培养2天，以诱导血管祖细胞（vascular progenitors, VPs）。在部分实验中，研究者还分别或联合使用BMP4、FGF2和VEGF以分析各因子的贡献。第4天用Accutase消化细胞，取形态呈铺路石样的周边细胞（peripheral cells）以富集血管祖细胞，因为流式细胞术显示周边细胞中CD31⁺CD144⁺双阳性比例可达84%，而中央细胞仅为55.6%，整个群体中约67.8%。第三阶段，将血管祖细胞以5×10³至1×10⁴细胞/cm²的密度接种，使用添加50 ng/ml VEGF的EC生长培养基MV2继续培养4至6天，最终获得内皮细胞。为进一步评估通路功能，研究者在诱导血管祖细胞和诱导ECs两个阶段分别加入MAPK及PI3K通路抑制剂：ERK通路抑制剂U0126和GDC-0994、p38通路抑制剂SB202190和BIRB 796、JNK通路抑制剂JNK inhibitor II和JNK-IN-8、以及PI3K抑制剂LY294002。基因表达分析采用定量RT-PCR（qRT-PCR），以GAPDH为内参计算相对表达量。细胞表型检测采用流式细胞术，抗体包括CD31、CD34和CD144。功能学评估包括DiI标记乙酰化低密度脂蛋白（DiI-Ac-LDL）摄取实验、体外基质胶成管实验、以及体内Matrigel栓血管形成实验。在体内功能评价中，研究使用了免疫缺陷NSG小鼠。一种方式是将1×10⁶个hESC-ECs与1/30稀释的Matrigel混合后皮下注射到NSG小鼠后肢，2周后取出Matrigel栓进行人CD31免疫染色。另一种方式是建立后肢缺血模型，对NSG小鼠进行股动脉结扎并切断以诱导单侧后肢缺血，术后1天向缺血肢肌肉注射1×10⁶个hiPSC-ECs或生理盐水。10周后经尾静脉注射FITC-葡聚糖标记血流并处死动物，取缺血腿部肌肉制备冰冻切片，进行人特异性CD31免疫染色及荧光分析。

在主要结果方面，第一阶段实验显示，单独使用FGF2即可显著降低多能性标志物OCT4的表达，而三种生长因子联合使用时OCT4下降最为明显。血管祖细胞标志物VEGFR2（KDR/Flk-1）的表达可被BMP4或VEGF单独显著诱导，BMP4与VEGF联合进一步上调其表达。FGF2单独不能诱导VEGFR2表达，甚至会降低VEGF诱导的VEGFR2表达，但在BMP4存在时FGF2并不抑制VEGFR2表达。内皮谱系标志物PECAM1和VE-cadherin在VEGF单独作用下仅中度升高，BMP4与VEGF联合可进一步增加，而三因子联合BMP4、FGF2和VEGF时表达最高。平滑肌细胞标志物α-SMA和造血细胞标志物CD45在各处理组均未显著升高，说明这些因子主要促进内皮谱系分化。在通路抑制实验中，抑制ERK、p38、JNK或PI3K均显著降低PECAM1表达，其中ERK和p38抑制剂作用最强。同时，ERK或p38抑制剂显著降低ERG、FLI1和ETS1等ETS家族转录因子表达，JNK或PI3K抑制剂作用较弱。p38抑制剂还中度降低FOXC2、ETV2和VEGFR2表达。增殖标志物Ki67仅在ERK和p38抑制剂处理时显著降低，但整体增殖水平仍与hiPSC相当。上述结果提示MAPK和PI3K通路对血管祖细胞的产生至关重要，可能通过调控ETS家族转录因子发挥作用。第三阶段分化结果显示，所获hiPSC-ECs和hESC-ECs呈现典型铺路石样内皮形态，免疫染色证实表达CD31和成熟EC标志物von Willebrand因子（vWF）。流式分析显示，94%–97%的细胞表达CD31，其中73%–81%为CD34⁺，78%–83%为CD144⁺。传代一次后，CD34表达下降，内皮表型进一步提高至99.7% CD31⁺和96.8% CD144⁺，这是目前已知不依赖分选或磁珠分离所获得的最高纯度之一。在功能检测中，多能干细胞来源的ECs与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）一样能摄取DiI-Ac-LDL，而hiPSCs则不能；这些ECs还能在Matrigel上形成管样结构。时间进程基因表达分析显示，OCT4和NANOG在分化前4天逐步下降，并在P3和P4代进一步降低至低于HUVECs水平。VEGFR2在D3达到峰值后中度下降，但仍显著高于hiPSCs和HUVECs。而VEGFR1仅从D3至D8轻度升高，提示其对EC分化的作用不及VEGFR2。转录因子ETV2在D3前逐步诱导，D4中度下降并在之后降至低于hiPSC水平；FOXC2则在D2至D8维持较高表达，P3和P4时下降。ERG、FLI1、ETS1和TAL1在D3被诱导并在此后保持较高水平。PECAM和VE-cadherin在D3显著升高，此后逐渐增加至接近HUVECs水平。vWF和NOS3在D4达到平台期，其中NOS3水平与HUVECs相当，但vWF水平较低，表明细胞尚未完全成熟。动脉内皮标志物JAG1和HEY1在D3至D4被强烈诱导，表达水平远高于HUVECs；静脉内皮标志物COUP-TF2和NRP2在D3升高，其中COUP-TF2水平低于HUVECs，而NRP2水平与之相当或更高。这些结果表明，所获ECs更接近于动脉内皮表型。平滑肌标志物α-SMA在D4至D6明显升高，但在P3和P4降至低于HUVECs水平；Calponin则随分化进行逐渐降低，说明该方案持续促进内皮命运而非平滑肌命运。在ECs阶段抑制通路的研究中发现，抑制PI3K、ERK、p38或JNK均可显著降低PECAM1和vWF表达，表明这些通路仍参与ECs分化。值得注意的是，抑制ERK和JNK可提高α-SMA表达，但只有抑制ERK能够强烈上调Calponin表达。免疫染色证实加入ERK通路抑制剂U0126后，α-SMA阳性细胞数量明显增加。而抑制PI3K对平滑肌标志物无显著促进作用，说明仅阻断内皮命运并不足以诱导平滑肌命运，ERK通路可能同时具有抑制平滑肌分化的功能。在体内实验中，hESC-ECs与Matrigel混合移植后2周即可形成具有分支的人CD31阳性血管结构。在缺血后肢模型中，接受hiPSC-ECs的小鼠后肢肌肉中检测到丰富的人CD31信号，这些细胞主要分布于靠近血流正常区域的缺血区域边缘。FITC-葡聚糖荧光与人CD31信号存在共定位或紧邻分布，说明移植ECs形成了与宿主血管系统相连的功能性血管，血液能够流经这些由多能干细胞来源ECs生成的血管。虽然未完全逆转缺血，但存在hiPSC-ECs的组织区域其FITC-葡聚糖信号相对较高，提示局部血流有所改善。

该研究成功建立了一种无需分选即可从hESCs和hiPSCs高效获得近纯ECs的培养方案，且这些ECs在体外能摄取DiI-Ac-LDL并形成管样结构，在体内能形成与宿主循环相连的功能性血管。研究首次系统揭示了p38和JNK通路在内皮细胞分化中的重要作用，并证明MAPK和PI3K通路在血管祖细胞形成和内皮命运决定中均不可或缺，其作用可能通过调控ERG和FLI1实现。此外，抑制ERK通路显著促进平滑肌细胞分化，提示ERK在内皮与平滑肌命运选择中具有关键开关作用。该研究为血管疾病的细胞治疗、缺血组织再血管化以及血管发育机制研究提供了重要的方法学平台和理论依据，具有较高的科学价值和应用潜力。