关于《小链脂肪酸丁酸盐拮抗小鼠表皮γδ T细胞TCR刺激诱导的代谢转变》的学术研究报告
本研究由德国杜塞尔多夫大学莱布尼茨环境医学研究所（IUF – Leibniz Research Institute for Environmental Medicine）的Lukas Häselbarth、荷兰糖尿病研究中心（German Diabetes Research Center）的D. Margriet Ouwens等学者共同完成，并于2020年3月9日发表在《EXCLI Journal》（卷19，页334-350）上。
一、 研究学术背景
本研究的核心科学领域是免疫代谢学，具体聚焦于皮肤免疫与代谢调节的交叉点。在免疫学中，T细胞被激活后，会经历显著的代谢重编程，从主要依赖线粒体氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation, OxPhos）产生三磷酸腺苷（Adenosine-Triphosphate, ATP），转变为更依赖快速但产能效率较低的糖酵解（Glycolysis）。这种现象被称为“沃伯格效应”（Warburg Effect），是效应T细胞满足其增殖和功能发挥所需大量能量与生物合成前体的关键机制。
短链脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids, SCFAs），主要包括丁酸盐（Butyrate）、丙酸盐（Propionate）和乙酸盐（Acetate），是肠道微生物发酵膳食纤维产生的代谢产物。大量研究表明，SCFAs，尤其是丁酸盐，在肠道中具有强大的抗炎作用，其机制包括：作为能量底物、作为组蛋白去乙酰化酶（Histone-Deacetylase, HDAC）抑制剂、激活G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors, GPRs）以及促进调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）的分化。皮肤作为另一具有高度免疫活性的器官，也定植着能产生SCFAs的共生菌（如痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌）。然而，与肠道相比，皮肤中的SCFA浓度要低得多（从毫摩尔级降至微摩尔级），因此SCFAs是否以及如何调节皮肤免疫细胞的功能尚不清楚。
此前研究表明，局部应用丁酸盐可增加小鼠皮肤中的常规αβ Tregs数量。然而，皮肤中最主要的常驻T细胞是树突状表皮T细胞（Dendritic Epidermal T Cells, DETCs），它们属于先天性γδ T细胞，在皮肤免疫监视、伤口愈合和炎症反应（如分泌促炎细胞因子干扰素-γ）中起着核心作用。DETCs在活化时是否也经历类似的代谢转变，以及SCFAs能否影响DETCs的代谢和功能，是一个未知且具有重要生理和病理意义的问题。
因此，本研究的主要目的是：探究T细胞受体（T Cell Receptor, TCR）刺激是否诱导小鼠DETCs发生代谢转变，以及SCFAs（丁酸盐、丙酸盐、乙酸盐）能否影响DETCs的能量代谢及其关键的炎症功能（特别是干扰素-γ的分泌），从而探讨SCFAs作为皮肤炎症潜在调节剂的可能性。
二、 详细研究流程
本研究采用小鼠DETC细胞系（7-17细胞）作为研究对象，系统地进行了一系列体外实验，工作流程严谨且环环相扣。
1. SCFAs对细胞活力的影响评估： * 研究样本与处理： 使用7-17 DETC细胞系。实验分为两部分：(a) 细胞在不接受刺激的情况下，分别用不同浓度（0.1 mM至100 mM）的丁酸盐、丙酸盐或乙酸盐处理6小时或24小时。(b) 细胞在通过抗CD3ε/抗CD28抗体交联进行TCR刺激的同时，加入5 mM的SCFAs处理6小时或24小时。 * 实验方法： 采用MTT比色法评估细胞活力。MTT被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为不溶于水的蓝紫色甲臜结晶，其数量与活细胞数量成正比，通过测量其在570 nm处的吸光度来间接反映细胞活力。 * 数据分析： 将各处理组的吸光度值与未处理对照组（设定为100%活力）的平均值进行比较，进行归一化处理。使用配对单因素方差分析（One-way ANOVA）和Dunnett多重比较检验，评估SCFA处理组与对照组的统计学差异。
2. SCFAs对细胞表面标志物表达的影响： * 研究样本与处理： 7-17细胞在有或无TCR刺激（抗CD3ε/抗CD28抗体）的条件下，同时加入5 mM SCFAs处理6小时。 * 实验方法： 采用流式细胞术（Flow Cytometry, FACS） 定量分析细胞表面蛋白表达。处理后收集细胞，用抗CD16/32抗体阻断Fc受体，然后用荧光标记的抗Vγ3TCR抗体（标记DETCs）和抗CD69抗体（早期激活标志物）进行染色。使用DAPI染色排除死细胞。在BD Aria III流式细胞仪上检测单细胞荧光强度。 * 数据分析： 通过前向散射和DAPI染色排除死细胞和细胞团块。分析活细胞中Vγ3TCR和CD69的中位荧光强度（Median Fluorescence Intensity, MDFI），用于描述表面表达水平。使用配对双因素方差分析（Two-way ANOVA）及事后检验（Sidak或Dunnett法）进行统计分析。
3. SCFAs对细胞代谢谱的影响： * 研究样本与处理： 7-17细胞先进行TCR刺激（20小时）或不刺激，然后在代谢测量前1小时，加入5 mM的SCFAs或溶剂对照。 * 实验方法： 采用Seahorse XF细胞能量代谢分析技术，这是一种实时、无创检测细胞代谢通量的先进平台。本研究结合了线粒体压力测试和糖酵解速率测试。将细胞接种在预先包被抗CD3ε或模拟包被的96孔板上，给予或不给抗CD28抗体刺激。20小时后，更换为特定的Seahorse检测培养基（含或不含SCFAs）。在37°C、0% CO₂条件下平衡1小时后，使用Seahorse XFe96分析仪进行测量。依次注入以下抑制剂：(1) 寡霉素（Oligomycin，抑制ATP合酶，反映线粒体ATP产生相关的耗氧）; (2) 抗霉素A/鱼藤酮（Antimycin A/Rotenone，抑制线粒体呼吸链复合物III/I，反映非线粒体耗氧）; (3) 2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose，2-DG，竞争性抑制糖酵解）。 * 数据分析： 仪器实时记录氧消耗速率（Oxygen Consumption Rate, OCR） 和细胞外酸化速率（Extracellular Acidification Rate, ECAR），软件将其转化为质子外排速率（Proton Efflux Rate, PER）以更精确反映糖酵解。计算以下关键参数：基础呼吸（Basal Respiration，抑制剂添加前的平均OCR，反映线粒体氧化磷酸化水平）、基础糖酵解（Basal Glycolysis，抑制剂添加前的平均PER，反映糖酵解水平）、糖酵解/呼吸比值、总ATP产生速率（糖酵解ATP + 线粒体ATP）以及糖酵解ATP占比。数据经过实验间和实验内变异的校正。使用配对双因素方差分析或混合效应模型进行统计。
4. SCFAs对细胞因子分泌的影响： * 研究样本与处理： 7-17细胞在TCR刺激（抗CD3ε/抗CD28抗体）的同时，加入5 mM SCFAs处理6小时。 * 实验方法： 收集细胞培养上清液，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA） 定量检测其中干扰素-γ（Interferon-gamma, IFNγ） 的浓度。严格按照试剂盒（BioLegend）说明书操作，每个样本设技术复孔。 * 数据分析： 测量450 nm处吸光度，以570 nm为参考波长校正。根据标准曲线计算IFNγ浓度。使用配对双因素方差分析和Sidak多重比较检验分析SCFA处理对IFNγ分泌的影响。
三、 主要研究结果
1. SCFAs的毒性具有刺激依赖性和时间依赖性： 在无刺激条件下，即使5 mM的丁酸盐、丙酸盐或乙酸盐处理24小时，对7-17细胞活力也无显著毒性（100 mM才显示轻微毒性）。然而，当细胞同时接受TCR刺激时，情况发生显著变化：处理6小时无毒性，但处理24小时后，5 mM的丁酸盐使细胞活力下降约80%，丙酸盐使其下降约50%，乙酸盐仍无影响。这表明TCR激活使得DETCs对丁酸盐和丙酸盐的毒性变得敏感，提示SCFAs可能通过促进激活诱导的细胞死亡（AICD）来清除过度激活的T细胞，从而限制炎症损伤。
2. 丁酸盐和丙酸盐上调早期激活标志物CD69的表达： 流式细胞术结果显示，TCR刺激本身可显著上调7-17细胞表面CD69的表达（与未刺激组相比）。重要的是，在有或无TCR刺激的情况下，加入5-10 mM的丁酸盐或丙酸盐（而非乙酸盐）都能进一步、稳定地增加CD69的表面表达。CD69是组织驻留T细胞的特征标志，与免疫调节功能相关，其上调提示丁酸盐和丙酸盐可能促使DETCs向更具调节性或功能重塑的状态转变。
3. 丁酸盐拮抗TCR刺激诱导的代谢转变： 这是本研究的核心发现之一。Seahorse代谢分析首次证实，小鼠DETCs在TCR刺激后确实发生了代谢重编程，表现为基础糖酵解显著增强，同时基础呼吸中度增加，即出现了类似沃伯格效应的代谢转变，糖酵解/呼吸比值升高。 更重要的是，在代谢测量前1小时加入SCFAs处理，产生了显著影响： * 丁酸盐：强烈抑制了TCR刺激引起的糖酵解升高，同时似乎轻微增强了线粒体呼吸，导致糖酵解/呼吸比值显著降低，并将能量产生途径显著推回线粒体氧化磷酸化方向（糖酵解ATP占比显著下降）。 * 丙酸盐和乙酸盐：也显示出抑制糖酵解的趋势，但效应弱于丁酸盐。乙酸盐似乎同时轻微抑制了呼吸。 * 总ATP产量：TCR刺激后仅显示中等程度的增加，且不受SCFA处理的显著影响，表明SCFAs主要改变了能量的来源途径（代谢燃料偏好），而非总能量产出水平。 这些结果表明，丁酸盐能有效拮抗DETCs活化后的代谢转变，逆转其向糖酵解的倾斜。
4. 丁酸盐和丙酸盐抑制促炎细胞因子IFNγ的分泌： ELISA结果显示，TCR刺激强烈诱导7-17细胞分泌IFNγ。同时加入5 mM的丁酸盐或丙酸盐（而非乙酸盐）处理6小时，能显著降低IFNγ的分泌量。这一功能学结果与上述代谢和表型改变高度一致：代谢向氧化磷酸化回调，以及CD69表达上调（已知CD69信号可负调控IFNγ），共同指向DETCs炎症潜能的降低。
四、 研究结论与价值
本研究得出明确结论：皮肤常驻的γδ T细胞（DETCs）在抗原激活时会发生从氧化磷酸化向糖酵解的代谢转变。生理相关浓度的短链脂肪酸，尤其是丁酸盐，能够拮抗这一代谢转变，减少DETCs的糖酵解依赖，并同时上调免疫调节表面受体CD69的表达，最终抑制其促炎细胞因子IFNγ的分泌。
科学价值： 1. 机制创新：首次在皮肤γδ T细胞中证实了SCFAs对免疫代谢的调节作用，将肠道免疫代谢的重要调节分子SCFAs的功能拓展至皮肤这一重要屏障器官，深化了对“肠-皮轴”免疫对话机制的理解。 2. 靶点发现：揭示了SCFAs（尤其是丁酸盐）作为DETCs代谢和功能调节剂的潜力，为通过代谢干预调控皮肤炎症提供了新的理论依据和潜在靶点。 3. 功能关联：将代谢改变（糖酵解抑制）、表型改变（CD69上调）与功能输出（IFNγ减少）有机联系起来，构建了一个SCFAs调控DETCs炎症活性的潜在通路框架。
应用价值： 研究结果支持并拓展了此前关于局部SCFA治疗可缓解皮肤炎症的观点。提示局部补充丁酸盐或丙酸盐，或通过调节皮肤菌群增加局部SCFA产量，可能成为一种通过调节皮肤常驻T细胞代谢和功能来治疗过度炎症性皮肤疾病（如特应性皮炎、银屑病）的新策略。尽管仍需在体实验验证，但本研究为这种疗法的开发提供了坚实的体外实验证据和机制线索。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的讨论
作者在讨论部分提出了几个值得深入探索的机制问题： 1. 毒性机制：TCR刺激增强丁酸盐/丙酸盐毒性的现象，可能与SCFAs作为HDAC抑制剂上调Fas死亡受体表达，从而促进激活诱导的细胞死亡有关，这本身可能是一种限制炎症的生理性反馈机制。 2. CD69上调机制：丁酸盐/丙酸盐诱导CD69表达，可能与激活转录因子AP-1有关，而SCFAs对NF-κB的抑制可能限制了CD69上调的幅度。CD69上调可能通过增强色氨酸摄取或其它信号通路影响DETCs的分化和功能。 3. 代谢影响的机制：短期（1小时）SCFA处理引起的代谢变化，可能主要源于其作为能量底物进入三羧酸循环，竞争性或替代性影响葡萄糖代谢；而长期效应可能涉及通过HDAC抑制改变代谢相关基因的表达。 4. IFNγ抑制的机制：可能是多因素共同作用的结果，包括：(a) 糖酵解被抑制（已知糖酵解酶GAPDH在糖酵解停滞时可结合IFNγ mRNA抑制其翻译）；(b) CD69表达增加（CD69信号可负调控IFNγ）；© SCFAs作为HDAC抑制剂对IFNγ基因座的直接表观遗传调控。 5. 受体与转运体：DETCs表达SCFAs的受体（GPR41, GPR43, GPR109a），SCFAs如何被摄入细胞（通过被动扩散或主动转运），这些具体机制在DETCs中均有待阐明。
这项研究为理解皮肤免疫稳态的代谢调控机制提供了重要新知，并指出了靶向皮肤菌群代谢产物或局部代谢干预在炎性皮肤病治疗中的广阔前景。