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研究报告
本研究由Christine M. O’Brien、Kevin W. Bishop、Haini Zhang、Xiao Xu、Leo Shmuylovich、Elizabeth Conley、Karen Nwosu、Kathleen Duncan、Suman B. Mondal、Gail Sudlow和Samuel Achilefu等人完成，主要作者来自华盛顿大学医学院放射学系（Department of Radiology, Washington University School of Medicine）和华盛顿大学生物医学工程系（Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis）等机构。该研究于2022年10月6日在线发表于Biomedical Optics Express期刊第13卷第11期，论文标题为《利用双波长激发荧光的定量肿瘤深度判定》（Quantitative tumor depth determination using dual wavelength excitation fluorescence）。
该研究属于生物医学光学与荧光引导手术（Fluorescence-Guided Surgery，FGS）的交叉领域。研究背景在于：实体瘤切除手术中，实现肿瘤周围健康组织的完整切缘（negative margin）对于降低复发风险至关重要，但术中对切缘厚度的精确评估仍面临挑战。现有方法如组织病理学虽为金标准但耗时且需二次手术，而近红外（Near-Infrared，NIR）荧光成像虽能探测数毫米至厘米深度的荧光信号，却无法直接定量发光深度。为此，课题组开发了一种基于双波长激发荧光（Dual Wavelength Excitation Fluorescence，DWEF）的比率荧光成像策略，利用组织对光衰减的波长依赖性，通过测量不同激发波长下荧光强度的比值来反演荧光团深度。该方法不依赖荧光团浓度，且硬件简单、成本低，适合临床转化。
研究流程分为五个主要环节。第一环节是DWEF深度测定原理的建立与系统构建。研究使用肿瘤靶向NIR荧光团LS301，其激发光谱覆盖约650–810 nm。系统采用730 nm和780 nm两个LED作为激发光源，通过二向色镜合束，由单色CMOS相机采集荧光图像，并加入850 nm LED获取明场图像用于空间配准。成像系统封装在便携式外壳内，可在手术室或病理室正常照明条件下工作，完成一次数据采集与分析不超过5分钟。系统还集成了一套基于Matlab App Designer编写的图形用户界面（Graphical User Interface，GUI），用于控制LED时序、相机采集以及后续图像分析。第二环节是光学性质测定。研究采用漫反射光谱（Diffuse Reflectance Spectroscopy，DRS）和积分球（Integrating Sphere，IS）两种方法分别测量组织模拟体模、鸡胸肉组织和小鼠肿瘤组织的光学吸收系数（μa）与约化散射系数（μs’）。DRS通过单源-探测器光纤束采集漫反射光谱，利用Farrell扩散模型和Jacques光谱约束拟合提取光学参数。IS则基于逆倍增法（Inverse Adding-Doubling，IAD）获得独立验证。第三环节是在合成组织模拟体模和鸡胸肉组织中进行深度预测验证。研究者制备了含TiO2散射剂和IR125荧光剂的聚氨酯荧光参考体模用于宽场校正，以及不同厚度（1–5 mm）的聚氨酯组织模拟薄片和鸡胸肉组织片。将荧光体模上方逐层叠加组织模拟层或鸡胸肉层，采集DWEF图像并归一化至零深度时的比值，同时利用DRS和IS预测的斜率构建深度查找表，比较预测深度与卡尺实测深度。第四环节是小鼠乳腺癌模型的在体验证。4只SCID beige小鼠皮下接种MDA-MB-468人乳腺癌细胞，待肿瘤长至约1 cm后尾静脉注射LS301。48小时后，先对3只小鼠进行在体DRS光学参数测量（第4只小鼠使用前3只的平均值），然后进行DWEF成像，提取肿瘤上方组织切缘厚度。成像结束后处死小鼠，将肿瘤连同皮肤完整切除，沿轴面切开，对切面进行荧光成像以量化肿瘤核心至组织表面的实际切缘厚度作为金标准。在体DWEF深度测量与离体切缘厚度进行逐点比较，同时比较了单波长780 nm激发的荧光信号-背景比（Signal-to-Background Ratio，SBR）与离体切缘厚度的相关性。第五环节是数据分析与统计。利用线性拟合评估比率荧光信号与深度之间的关系，计算斯皮尔曼（Spearman）相关系数，并对所有小鼠的DWEF与SBR结果进行汇总分析。
主要实验结果显示，在合成组织模拟体模中，荧光比率的自然对数与组织层厚度呈高度线性关系，拟合优度R²为0.99；使用IS和DRS预测斜率与实测数据的拟合优度R²分别为0.97和0.99，平均深度预测误差为164 μm，标准差56 μm。在鸡胸肉组织中，线性拟合R²为0.89，基于DRS光学性质的预测斜率的R²为0.86，平均误差为0.47 mm，标准差0.29 mm。误差增大主要归因于生物组织的异质性和鸡胸肉层厚度测量本身的不确定性。在小鼠乳腺癌模型中，4只小鼠的DWEF在体深度预测与离体金标准切缘厚度之间的平均误差为0.36 mm，标准差0.23 mm。将4只小鼠所有像素点的DWEF测量值与金标准对比并进行过原点线性拟合，斜率为1.02，表明DWEF能够定量反映绝对深度；而基于SBR的拟合斜率仅为2.194，斯皮尔曼相关系数也低（DWEF为0.68，SBR为0.22），说明SBR与深度仅有弱相关，无法提供可靠的绝对深度信息。此外，在体DWEF成像成功识别了肿瘤核心上方从表面到肿瘤边界的切缘厚度，且与离体切面荧光图像中肿瘤边缘和组织的分界深度吻合良好。
本研究结论认为，所开发的NIR DWEF系统可在组织模拟体模、鸡胸肉层状模型以及小鼠乳腺癌在体模型中高精度地定量荧光团深度。与常用的SBR指标相比，DWEF能够提供与深度1:1对应的绝对定量信息。系统具有成本低、便携、数据采集快（分钟）等优势，适合在手术室或病理室中用于术中切缘评估。该技术的科学价值在于首次将比率荧光深度映射方法推广至近红外波段，利用NIR荧光团的高穿透深度和低自发荧光背景，为实现术中肿瘤切缘的精准定量提供了一种简单、稳健的解决方案。应用价值方面，该技术有望与现有的术中标本成像流程（如CT扫描）衔接，帮助外科医生在手术中评估肿瘤切缘是否足够，从而减少二次手术需求并保留更多健康组织。未来工作包括引入空间频域成像或漫反射成像以实现二维光学参数分布提取，以及在软件层面实现自动化深度图谱生成。
本研究的亮点包括：将DWEF从可见光扩展到近红外，并采用临床进展中的肿瘤靶向荧光团LS301进行在体验证；成功构建了基于LED和CMOS相机的低成本便携式成像系统，避免了复杂光学系统；在体小鼠实验中直接与金标准组织学切面荧光图像对比，验证了绝对深度定量的准确性；结果显示DWEF显著优于传统SBR指标，为FGS中的切缘评估提供了有说服力的定量工具。