本研究由首都医科大学宣武医院神经内科的郝俊伟教授团队主导完成，共同第一作者包括郑凯和林玲敏，研究单位还包括天津医科大学总医院天津神经病学研究所。该论文于2022年发表在Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism第42卷第1期上，题目为“Single-cell RNA-seq reveals the transcriptional landscape in ischemic stroke”。
缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）是全球第二大可预防性死亡原因，可导致长期的神经和精神功能障碍。长期以来，由于中枢神经系统（central nervous system，CNS）存在显著的细胞异质性，难以准确定义不同脑细胞亚群在缺血性脑卒中发病和进展过程中的具体作用，这极大地限制了有效治疗手段的开发。既往的转录组学研究主要基于组织混合物的大量细胞群体分析（bulk tissue analysis），这种方法掩盖了特定易感细胞亚群中关键基因表达谱的变化。为突破这一瓶颈，研究团队首次采用单细胞RNA测序技术（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq），在单细胞水平上全面解析缺血性脑卒中急性期脑细胞的转录组变化，旨在揭示细胞亚型特异性的分子标志物，为理解疾病机制和发现药物靶点开辟新领域。
研究的整体流程包括动物模型构建、脑组织单细胞分离、10x Genomics单细胞RNA测序、数据质控与整合、细胞聚类与鉴定、差异基因表达分析、亚群细分与轨迹分析、转录调控网络推断以及免疫验证等多个步骤。
在动物实验阶段，研究团队采用成年小鼠大脑中动脉闭塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）来模拟缺血性脑卒中。实验组为三只MCAO小鼠，对照组为三只假手术（sham）小鼠，均在缺血再灌注24小时后处死并取脑。选择该时间点的依据在于，缺血性脑卒中起病急、发展迅速、治疗时间窗窄，急性期的早期干预对治疗至关重要。为全面捕获大脑中的细胞群体且避免因使用特定细胞表面标志物造成偏差，研究者从MCAO组和假手术组各自动物的缺血侧大脑半球（cerebral hemisphere）中直接分离了所有的单细胞，而未进行预分选。
在单细胞测序阶段，采用10x Genomics技术平台对分离的单细胞进行转录组文库构建和测序。经过严格的质量控制（quality control），研究一共回收了58,528个高质量单细胞，平均每个细胞检测到1,295个基因和2,610个唯一分子标识符（unique molecular identifiers，UMIs）。
在生物信息学分析流程中，研究人员使用Seurat 3软件包进行数据整合和批次效应校正（batch-effect correction），然后通过t分布随机邻域嵌入算法（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）将单个细胞投影到二维空间进行可视化。通过检测已知细胞类型标志物的表达，研究成功鉴别出17个主要细胞簇（clusters），包括血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，SMC）、血管周成纤维细胞样细胞（perivascular fibroblast-like cells，FB）、中枢神经系统边界相关巨噬细胞（CNS-associated macrophages，CAM）、单核细胞来源细胞（monocyte-derived cells，MDC）、静脉内皮细胞（venous endothelial cells，VEC）、毛细血管内皮细胞（capillary endothelial cells，capec）、动脉内皮细胞（arterial endothelial cells，AEC）、周细胞（pericytes，PC）、脉络丛毛细血管内皮细胞（choroid plexus capillary endothelial cells，CPC）、室管膜细胞（ependymocytes，EPC）、小胶质细胞（microglia，MG）、中性粒细胞（neutrophils，NEUT）、星形胶质细胞（astrocytes，ASC）、少突胶质细胞（oligodendrocytes，OLG）、神经前体细胞（neural progenitor cells，NPC）、淋巴细胞（lymphocytes，LYM）和红细胞（red blood cell，RBC）。
为进一步挖掘细胞异质性，研究还分别对特定类型的细胞进行了亚群聚类分析。对小胶质细胞、CAM、髓系来源细胞（包括单核/巨噬细胞、树突状细胞）、中性粒细胞、淋巴细胞以及脑血管系统的内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞和成纤维细胞样细胞等均进行了深入的亚群细分。在轨迹分析方面，使用Monocle 2中的BEAM算法对单核/巨噬细胞的分化轨迹进行拟时间（pseudotime）排序，揭示了缺血损伤后这些细胞的潜在分化分支。在转录调控网络分析中，采用了SCENIC算法以鉴定不同小胶质细胞亚型中的关键转录因子（transcription factors，TFs）及其调控元（regulons）。此外，研究还利用CellPhoneDB数据库进行了配体-受体相互作用分析，以推断缺血性脑卒中状态下脑细胞间的通讯变化。
在实验验证环节，研究团队采用免疫荧光染色（immunofluorescence staining）和流式细胞术（flow cytometry）对部分关键差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）在蛋白质水平上的变化进行了验证。
全局细胞图谱与比例变化：研究发现，MCAO组与假手术组相比，脑内细胞构成比例发生显著变化。其中，单核细胞来源细胞（MDCs）的比例从2%急剧上升至16%，中性粒细胞和周细胞的比例也明显增加，而血管内皮细胞和血管周成纤维细胞样细胞的比例则略有下降。这一结果直观地反映了急性缺血后外周免疫细胞的大量浸润和脑内细胞群的重塑。
全局差异基因与通路分析：比较MCAO组与假手术组之间的差异基因发现，小胶质细胞中鉴定出多达275个显著变化的基因，位居各细胞类型之首，提示小胶质细胞是主导缺血后神经炎症（neuroinflammation）的核心角色。不同细胞类型特异的差异基因富集于不同的生物通路，如小胶质细胞富集于中性粒细胞趋化性和凋亡信号通路，星形胶质细胞富集于信号转导，少突胶质细胞富集于神经元凋亡过程的调控。最重要的是，单细胞水平与组织整体水平（bulk tissue）的差异基因重叠分析显示，约80%在单细胞水平鉴定的差异基因在组织整体分析中未被检测到，这凸显了单细胞测序技术在恢复可能在疾病调控中起关键作用的稀有细胞类型特异性基因方面的巨大优势。
细胞类型特异性基因表达变化：研究识别出一系列缺血损伤相关的细胞类型特异性标志物。例如，小胶质细胞标志物P2ry12在缺血后特异性下调，这与既往报道的小胶质细胞激活后形态变为阿米巴样、该基因表达下降一致。Lpl和Cd72则在小胶质细胞中特异性上调。Gfap作为反应性星形胶质细胞增生的关键标志物，其上调主要在星形胶质细胞中观察到。此外，研究还发现了一些跨多种细胞类型共同变化的基因（pan-brain DEGs），如Spp1（骨桥蛋白）、Lilrb4a、Cxcl2和Saa3等。免疫荧光和流式细胞术验证了Gpd1在少突胶质细胞、Ccl11在周细胞、Cd72和Lilrb4在小胶质细胞中的缺血后上调。
小胶质细胞亚群的异质性：对微胶质细胞的深入分析揭示了五种独特的亚群（MG0-MG4）。MG0主要来自假手术组；MG2、3、4主要来自MCAO组；MG1则由两组细胞共同构成。所有亚群都表达核心小胶质细胞标志物（如Gpr34、Tmem119、P2ry12），但这些标志物在最炎性的MG2、3、4亚群中表达相对较低。MG1亚群高表达单核细胞趋化蛋白家族基因（如Ccl12、Ccl2、Ccl7）。MG2亚群是与缺血损伤最相关的亚群，显著表达神经退行性疾病相关小胶质细胞的标志基因谱（如Lgals3、Lilrb4、Spp1）以及Mmp12和Adam8。MG3亚群高表达干扰素（interferon，IFN）信号通路基因（如Isg15、Ifit3、Cxcl10）。MG4亚群则高表达增殖相关标记物（如Birc5、Top2a），被定义为小胶质细胞的增殖池。SCENIC分析进一步鉴定了各亚群的关键转录因子，例如在MCAO组亚群中观察到缺氧感受器Hif1a的活跃，以及调控NF-κB通路的Spi1的活性。
其他免疫细胞的异质性：中枢神经系统边界相关巨噬细胞（CAMs）被细分为六个亚群，其中CAM4高表达MHCII类抗原呈递分子。单核/巨噬细胞被分为八个亚群，拟时间轨迹分析揭示了它们沿三个主要分支分化的轨迹：Ly6clo单核细胞和Ly6chi单核细胞_2占据一个分支，类似常驻巨噬细胞占据第二个分支，而Mo_cxcl2、Ifnic mo和Mo/mu_spp1则占据其余分支。中性粒细胞被分为四个亚群，从骨髓中新招募的成熟中性粒细胞亚群（NEUT0）高表达动员信号Cxcl1，而NEUT1则以1型干扰素刺激基因为特征。
脑血管及胶质细胞的异质性：研究发现血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、周细胞和血管周成纤维细胞样细胞在缺血后均表现出多个亚群和差异的基因表达模式。血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）相关的内皮细胞亚群（EC3）参与KRAS/MAPK通路调控。少突胶质细胞、星形胶质细胞和室管膜细胞等也在缺血后呈现不同的亚群组成和特异的功能富集，例如室管膜细胞的一个亚群高表达免疫应答基因。
细胞间通讯的变化：CellPhoneDB分析显示，在假手术组中，脑细胞间的相互作用景观以血管周成纤维细胞样细胞为主导。而在MCAO组中，这种相互作用显著减少，取而代之的是以小胶质细胞和CAM为核心的通迅网络急剧增加，尤其是小胶质细胞与其他免疫细胞、星形胶质细胞、周细胞和少突胶质细胞之间的相互作用。缺血卒中专有的细胞互作主要包括趋化因子、细胞因子和TNF家族信号通路（如CCL2、CCL5、IL1A、TNF）。尤为值得关注的是，研究首次发现了Spp1+小胶质细胞与Ptger4+ CD8+ T细胞之间通过SPP1-PTGER4配体-受体对的相互作用，并在梗死灶周围区域的脑切片上通过共定位分析进行了验证。
本研究首次构建了缺血性脑卒中急性期小鼠大脑单细胞转录组图谱，全面揭示了脑细胞表型异质性和各细胞亚型独特的基因表达模式。研究结论指出，单细胞RNA测序在神经炎症过程中精确揭示了单细胞水平的转录变化，为基于细胞亚型特异性分子探索卒中疾病机制和药物发现开辟了新视野。这项工作的科学价值在于，它用无偏倚的高通量高分辨率数据替代了传统的基于少数标志物的细胞分类方法，证明了M1/M2极化二分法对小胶质细胞/巨噬细胞状态的描述是过度简化的，真实情况是多极化的复杂亚群状态。在应用价值方面，鉴定出的细胞类型特异性基因有潜力作为分子影像学生物标志物，服务于卒中患者的动态疾病监测；而跨多种细胞类型均发生改变的基因，可作为治疗干预的最脆弱靶点。
本研究的亮点主要体现在三个方面。首先，在研究对象上是第一项在成年小鼠缺血性大脑中应用单细胞RNA测序进行全局转录组图谱绘制的研究，提供了宝贵的大规模数据资源。其次，在发现层面，研究不仅精细描绘了小胶质细胞的五种功能亚型及其转录调控网络，还首次报道了多种细胞亚型及潜在的细胞通讯机制（如SPP1-PTGER4），深化了对脑卒中神经炎症复杂网络的认知。再次，在方法论上，通过比较单细胞测序和模拟的bulk测序结果，直观且有力地证明了单细胞技术在发掘隐秘在群体信号下的稀有细胞特异性分子事件上的不可替代的优势，为未来精准靶向治疗奠定了细胞分子层面的基础。