本研究由Yasuaki Iwama等来自日本多家研究机构的学者合作完成，包括RIKEN生物系统动力学研究中心、大阪大学医学研究院、国立产业技术综合研究所等。该研究于2024年11月12日发表在《stem cell reports》期刊（卷19，1524-1533页），题为”Transplantation of human pluripotent stem cell-derived retinal sheet in a primate model of macular hole”。

学术背景

黄斑裂孔（macular hole, MH）是涉及中央凹的视网膜缺损，会导致视力受损。虽然现代玻璃体视网膜手术技术已使MH闭合率超过90%，但高度近视、大型/慢性MH等难治性病例仍存在挑战。目前自体视网膜移植（autologous retinal transplantation, ART）虽能实现解剖学成功，但存在供体区视野缺损、移植片以视杆细胞（rod photoreceptor）为主等问题。本研究旨在评估人类多能干细胞（pluripotent stem cell, PSC）来源的视网膜类器官（retinal organoid, RO）片移植治疗MH的可行性，使用非人灵长类模型验证其效果。

研究流程与方法

1. 动物模型制备

选用日本猕猴作为MH模型，通过光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）确认右眼存在直径约410μm的外核层（outer nuclear layer, ONL）缺损，左眼为<100μm的小缺损（自发性部分闭合）。模型通过玻璃体切除术（pars plana vitrectomy, PPV）联合内界膜（internal limiting membrane, ILM）剥离模拟难治性MH。

2. 干细胞移植片制备

使用基因修饰的Islet1⁻/⁻ CRX::Venus人类胚胎干细胞（human embryonic stem cell, hESC）系（hESC-KHES-1），其特点为：
- 特异性标记光感受器（photoreceptor, PR）的Venus荧光
- 缺乏ON双极细胞（ON-bipolar cells, BPCs）以促进宿主-移植物整合
分化约60天的RO片被裁剪为适配MH大小的移植片（视频S1）。

3. 手术移植

手术采用25G微创玻璃体切除系统，关键步骤包括：
- 后极部ILM剥离后确认MH开放（直径330μm）
- 将RO片边缘嵌入宿主MH空间下（术中OCT实时监控）
- 避免硅油填塞，仅进行气液交换
术后辅以球周注射糖皮质激素（地塞米松）及口服环孢素免疫抑制。

4. 术后评估

• 解剖学评估：每月OCT、荧光素血管造影（fluorescein angiography, FA）、自发荧光成像（fundus autofluorescence, FAF）监测MH闭合及排斥反应。
  
• 功能评估：
  
  • 眼动固视测试（eye fixation test）：比较术前术后正确注视比例（4°×4°窗口标准）
    
  • 局部视网膜电图（focal macular ERG）：分析a波（光感受器反应）和b波（双极细胞反应）振幅
    
• 组织学分析：术后200天取材，通过：
  
  • 免疫组化（IHC）检测干细胞标记（STEM121）、光感受器标记（RCVRN、视蛋白等）
    
  • 电子显微镜（EM）观察宿主-移植物界面超微结构
    

主要结果

1. 解剖学闭合：移植后1个月OCT显示RO片完全填充MH空间（图2a），且无胶质增生。移植片包含：

   • 视杆细胞（Rhodopsin阳性）
     
   • L/M-视锥细胞（OPN1LW/OPN1MW阳性）
     
   • S-视锥细胞（OPN1SW阳性）
     形成玫瑰花结样结构（图4c）。

2. 免疫排斥控制：术后4个月出现轻度排斥（内层视网膜水肿），经追加糖皮质激素注射后缓解（图2b-c）。CD4⁺ T细胞浸润局限于移植物-脉络膜界面，未检测到MHC II⁺活化小胶质细胞（图4g-h）。

3. 功能改善：

   • 固视测试正确率从术前1.5%显著提升至术后45/102次（p<0.0001，图3d-e）
     
   • 局部ERG显示b波振幅从0.43μV增至0.70μV（图3f），提示宿主ON-BPC功能恢复
     

4. 宿主-移植物整合：

   • EM观察到移植物PR内段（含线粒体）但未形成规则外段（图4i-j）
     
   • 未证实突触连接，可能因：评估周期不足、排斥反应干扰或宿主BPC仍保留原有PR伙伴
     

结论与价值

本研究首次证明hESC来源的RO片移植可实现：
1. 临床价值：
- 避免ART的供体区视野缺损
- 提供含视锥细胞的移植片，更适配中央凹需求
- 简化手术流程（无需取材外周视网膜）

1. 科学意义：
   
   • 验证了PSC移植片在灵长类MH模型的长期存活（>200天）
     
   • 证实基因修饰（Islet1敲除）策略在促进宿主-移植物整合中的潜力
     

研究亮点

1. 技术创新：

   • 结合术中OCT实时引导移植片定位
     
   • 开发CRX::Venus报告系统可视化PR分化
     

2. 发现突破：

   • 移植物视锥细胞自发分化为L/M型和S型
     
   • 轻度排斥反应可通过局部免疫调控解决
     

3. 转化意义：

   • 为难治性MH提供”现成”（off-the-shelf）移植材料
     
   • 建立灵长类MH模型的标准化评估流程（固视测试+局部ERG）
     

局限与展望

1. 需延长观察周期以评估突触形成可能性
   
2. 可优化移植片细胞组成（如增加视锥细胞比例）
   
3. 需进一步探索宿主内层视网膜与移植片的横向连接机制
   

该研究为干细胞治疗视网膜疾病提供了直接证据，推动了从基础研究向临床应用的转化。