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主要作者与机构

本研究的主要通讯作者为Jason E. Fish博士（任职于加拿大多伦多大学健康网络 Toronto General Hospital Research Institute）和Joshua D. Wythe博士（任职于美国贝勒医学院 Cardiovascular Research Institute）。共同第一作者包括Jason E. Fish、Carlos Perfecto Flores Suarez和Emilie Boudreau。该研究于2020年8月28日发表在*Circulation Research*（《循环研究》）期刊上，论文标题为“Somatic Gain of KRAS Function in the Endothelium Is Sufficient to Cause Vascular Malformations That Require MEK but Not PI3K Signaling”。

学术背景

脑动静脉畸形（brain arteriovenous malformations，bAVMs）是动脉与静脉之间绕过毛细血管网而形成的异常直接连接。由于血流和压力无法被正常消散，引流静脉可发生扩张和增大，并随着时间推移形成紊乱的血管巢（nidus），这是bAVM的标志性特征。bAVM是儿童和年轻成人出血性卒中的主要原因。目前临床上主要的治疗手段包括手术切除、血管内栓塞和立体定向放射治疗，但这些方法风险较高，且受病灶位置限制，并非对所有患者均适用。迄今为止尚无针对bAVM的药物疗法，主要原因在于对散发性bAVM起源和进展的生物学机制理解不足。

此前，该研究团队通过对切除的bAVM组织及匹配的外周血进行外显子组测序，发现约60%的散发性bAVM患者内皮细胞中存在*KRAS*（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homologue）基因的体细胞激活突变。*KRAS*编码Ras GTP酶，激活突变可阻止GTP水解，使KRAS持续处于活化状态。后续其他研究也证实了这一发现。此外，在bAVM中还检测到*BRAF*和*MAP2K1/MEK*（mitogen-activated protein kinase kinase 1）基因的激活突变，这些基因均作用于MEK/ERK（extracellular signal-regulated kinase）激酶级联通路，提示该通路在AVM发病中起关键作用。然而，此前尚无临床前研究验证单独激活KRAS是否足以驱动AVM形成，也不清楚活跃的KRAS信号如何促进病变发生。因此，本研究旨在建立首个体内模型，以直接观察内皮细胞中KRAS持续激活的细胞水平表型后果，并测试针对AVM的潜在治疗干预手段。

研究详细工作流程

本研究主要采用小鼠和斑马鱼两种模式动物，结合体外细胞实验，分以下几个主要部分展开。

第一部分：小鼠出生后早期内皮细胞表达KRASG12D。 研究者构建了他莫昔芬诱导、内皮细胞特异性Cre重组酶驱动的小鼠模型（*Cdh5(PAC)-CreERT2*，简称Cdh5-CreER）与条件性*Kras*突变等位基因（lox-stop-lox KrasG12D）的复合转基因小鼠。在出生后第1天（P1）给予他莫昔芬后，诱导内皮细胞特异表达KRASG12D。实验设置对照组（n=48）和iEC-KrasG12D组（n=138），通过Kaplan-Meier生存分析评估存活情况。对存活至P21的小鼠进行大体形态学分析、3D光片显微镜成像、免疫组织化学和血管密度分析。同时分析P14时脏器和心脏结构与功能。

第二部分：小鼠中枢神经系统内皮细胞出生后表达KRASG12D。 为避开全内皮表达导致的早期致死性，研究者使用*Slco1c1(BAC)-CreER*驱动系将突变KRAS表达限制在脑内皮细胞（iBEC-KrasG12D）。对P1小鼠给予他莫昔芬后，观察至8周龄。对照组（n=47）和iBEC-KrasG12D组（n=28）均进行存活分析、颅内出血评估，并通过荧光标记凝集素灌注结合落射荧光显微镜检查以及光学透明化结合光片共聚焦显微镜观察脑AVM形成情况。

第三部分：成年小鼠全内皮细胞表达KRASG12D。 研究者对2至4月龄成年iEC-KrasG12D小鼠给予他莫昔芬，分别在第8周和36周后评估存活率、颅内出血和脑AVM发生情况。通过荧光凝集素灌注和直接荧光显微镜检查脑表面血管，识别动静脉分流、静脉扩张和血管迂曲。

第四部分：斑马鱼胚胎内皮细胞表达突变KRAS。 利用Tol2转座子系统，将野生型或突变型人*KRAS*（G12V或G12D）构建体在内皮特异性*kdrl*启动子控制下进行嵌合表达。在1至4细胞期注射转基因构建体与转座酶mRNA，产生遗传嵌合胚胎，模拟人类患者中KRAS突变的体细胞性质。使用了多种转基因报告系，包括*kdrl:mCherry*、*kdrl:LifeAct-GFP*、*gata1:DsRed*和*fli1:nls-GFP*等。在受精后36至72小时（hpf）的不同时间点，通过共聚焦显微镜观察内皮细胞形态、异位出芽、血管管径、动静脉分流及颅内出血。此外，还使用Dll4:GFP、Notch报告系Tp1:GFP和自建的Ets报告系检测动脉-静脉身份和Ets转录活性。

第五部分：体外细胞实验。 使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）电穿孔转染对照质粒或KRASG12V质粒，结合LifeAct-GFP结构评估细胞面积变化。通过Transwell渗漏实验检测内皮屏障功能，评价KRASG12V表达以及MEK抑制剂（SL327或U0126）或PI3K抑制剂（LY294002）处理对通透性的影响。此外，进行RNA测序（RNA-seq）转录组分析，比较KRASG12V组与空载体对照组在不同药物处理条件下的差异表达基因，并利用基因本体（GO）富集分析鉴定KRAS诱导且依赖MEK或PI3K的分子通路。

第六部分：斑马鱼药物干预实验。 在受精后28小时给予1 μM MEK抑制剂SL327或溶媒DMSO，评估48小时时动静脉分流和颅内出血的发生率。为测试MEK在维持已形成分流中的作用，在36小时筛选存在分流的胚胎，随后给予SL327或DMSO处理24小时，统计分流逆转比例。同时以10 μM PI3K抑制剂LY294002进行对照干预，观察对已形成分流的影响。

主要研究结果

在第一部分实验中，P1诱导全内皮KRASG12D表达导致小鼠从P12左右开始出现显著致死性。存活至P21的小鼠表现出不完全外显的局灶性颅内出血（对照组0/116，iEC-KRASG12D组11/32），但未观察到皮层AVM。脑血管未扩张，反而呈现细薄和脆弱状态。P21脑内血管密度与对照组无显著差异，提示KRAS功能增益可能不刺激内皮细胞增殖。内脏器官未见明显出血，心脏结构和功能也未见一致性异常。致死原因尚不明确，但该模型因早死而阻碍了AVM形成，推测可能需要更长时间和血流动力学反馈才能形成bAVM。

在第二部分中，使用脑内皮细胞特异性*Slco1c1-CreER*驱动系后，iBEC-KrasG12D小鼠存活率在8周内未受影响（对照组0/47死亡，iBEC-KRASG12D组0/28死亡）。P21时脑内无出血（对照组0/14，iBEC-KRASG12D组0/7）。8周龄时，iBEC-KRASG12D小鼠中罕见颅内出血（1/28），但荧光凝集素灌注显示21只中11只出现bAVM，而对照组32只中0只出现。这些病变分布于皮层小脑前部及嗅球附近，表现为动静脉间直接分流、静脉扩张和血管迂曲，类似人类患者的血管巢结构。

在第三部分中，成年小鼠在2至4月龄时全内皮诱导KRASG12D表达，8周内无死亡（对照组0/23，iEC-KRASG12D组0/19），36周内也无死亡。8周后无颅内出血（两组均0例），但11只iEC-KRASG12D小鼠中6只出现bAVM，对照组15只中0只。36周时小样本队列中3只突变鼠2只出现bAVM。这表明在未受损的成年血管系统中，内皮细胞表达KRASG12D即足以诱导bAVM形成，无需额外血管生成或损伤刺激。

在第四部分斑马鱼实验中，表达KRASG12V的内皮细胞引起显著形态学改变。约39.0±6.7%的含KRASG12V内皮细胞的节间血管（ISVs）出现异位出芽，54.1±7.0%的ISVs管径明显增大，且约86%出现片状伪足样突起，形成不规则球状血管。KRASG12V表达的ISVs管腔扩张，充满红细胞。细胞自主性分析显示，ISV直径增加约2.1倍，但内皮细胞数量仅非显著增加约1.17倍，平均细胞面积则显著增加约1.7倍，表明管径扩张主要由细胞肥大而非增生导致。在HUVECs中，KRASG12V表达使细胞面积增加约1.9倍，与体内结果一致。

在动静脉分流方面，约47±4.5%的KRASG12V注射胚胎在尾轴血管中形成背主动脉与主静脉之间的分流，而KRASWT组无明显增加。颅内出血发生率约为19.7±4.6%，KRASWT组无此表型。脑部血管形态异常，表现为管径增大和异常血管连接。

在动脉-静脉身份方面，Dll4报告系显示KRASG12D表达未显著增强ISVs或背主动脉中的报告活性，但在分流处和部分静脉细胞中升高。Notch报告系Tp1:GFP在分流处仅显示中等活性，静脉细胞中未检测到表达，提示活跃KRAS并未显著改变动脉-静脉身份。自建的Ets报告系显示，KRASG12V表达细胞中Ets活性被诱导，包括分流处和静脉细胞，且在邻近无转基因细胞中也升高，提示KRAS可能通过激活Ets依赖性血管生成信号通路起作用。

在第五部分体外实验中，KRASG12V表达使HUVECs通透性增加约2倍，MEK抑制剂SL327或U0126处理可显著降低通透性，而PI3K抑制剂LY294002无影响。RNA-seq分析显示，KRASG12V使460个基因上调、236个基因下调。GO分析显示上调基因富集于血管生成、细胞周期、MAPK活性调节和RNA加工等过程；下调基因富集于细胞因子产生、应激反应和免疫应答等。药物阻断分析发现，MEK抑制剂影响147个KRAS诱导的转录本，涉及血管发育、细胞迁移调节和RNA加工等GO类别，而PI3K抑制剂仅影响21个独特靶点，且只有一个GO条目出现。这表明KRASG12V诱导的关键表型和分子改变主要依赖MEK而非PI3K。

在第六部分药物干预实验中，从28 hpf开始用SL327处理可显著降低KRASG12V注射胚胎的动静脉分流形成率。对已建立分流的胚胎，SL327处理24小时后约66%的胚胎分流逆转，而DMSO对照组仅约19%逆转。LY294002处理则对分流频率无影响。此外，SL327处理还可使KRASG12V引起的异位出芽形态恢复正常，并降低颅出血发生率。

结论与研究价值

本研究首次在体内证明了内皮细胞中KRAS功能获得突变足以驱动脑动静脉畸形形成，即使在未受损的成年血管系统中也是如此。研究还证明KRAS依赖性病变在斑马鱼中是可逆的，且MEK而非PI3K信号是必需的。这些结果表明，MEK抑制可能成为治疗bAVM患者的有前景的药物策略。

科学价值方面，该研究建立了首个KRAS依赖性bAVM的动物模型，为未来研究散发性bAVM的进展机制提供了重要平台。研究还揭示了KRAS驱动AVM的细胞机制，即通过增加内皮细胞大小、诱导异位出芽、扩张管腔和形成异常动静脉连接，而非通过改变细胞增殖或动脉-静脉身份。这些发现与既往体外实验一致，进一步完善了KRAS介导血管畸形的机制框架。

应用价值方面，由于KRAS本身难以作为药物靶点，靶向下游效应分子成为一种替代策略。研究显示MEK抑制剂可阻断甚至逆转已建立的动静脉分流，为该类疾病的药物干预提供了临床前证据。结合近期在癌症治疗中多个MEK抑制剂获批的背景，这些结果提示针对bAVM患者的临床试验具有可行性。

研究亮点

第一，本研究首次建立了内皮细胞特异性KRAS突变的体内模型，并在小鼠和斑马鱼两个物种中再现了bAVM的关键特征。第二，研究揭示了活跃KRAS并不依赖增强细胞增殖或改变动脉-静脉身份，而是通过增加细胞大小、诱导异位出芽和血管生成信号来驱动畸形形成，这一发现挑战了以往对血管畸形机制的某些假设。第三，斑马鱼实验显示MEK抑制可以逆转已建立的动静脉分流，具有直接的治疗意义。第四，研究通过RNA-seq和药物干预实验明确了KRAS下游效应通路的分工，证明MEK/ERK而非PI3K是KRAS驱动的关键通路。第五，本研究还开发了一种新的Ets报告系用于检测体内Ets转录活性，为后续研究提供了工具。

其他有价值内容

论文还讨论了不同Ras家族成员在内皮细胞中的独特作用。虽然*NRAS*和*HRAS*突变在其他血管畸形中被观察到，但散发性bAVM中似乎只有*KRAS*突变占主导。作者也指出，Hras活跃的小鼠模型产生了脑内毛细血管扩张和弥漫性出血，但未出现bAVM，提示不同Ras蛋白在血管形态发生和稳态中具有不同的功能。这些观点为未来理解Ras信号在血管疾病中的特异性提供了方向。此外，作者还强调，已存在数十年并经历广泛重塑的晚期人类脑血管病变是否同样对MEK抑制敏感，仍有待进一步研究，但近期有关曲美替尼（trametinib）治疗含*MAP2K1*突变的皮肤AVM的病例报告为这一方向提供了乐观信号。