作者：Hideki Tani、Koichiro Iha、Masayuki Shimojima、Shuetsu Fukushi、Satoshi Taniguchi、Tomoki Yoshikawa、Yoshihiro Kawaoka、Naoe Nakasone、Haruaki Ninomiya、Masayuki Saijo、Shigeru Morikawa
期刊：Journal of Virology
发表时间：2014年7月，第88卷第13期，页码7317–7330
沙粒病毒（arenavirus）是一类有囊膜的负链RNA病毒，隶属于沙粒病毒科（*Arenaviridae*），根据血清学、遗传学、地理分布及啮齿动物宿主的不同，被分为新世界沙粒病毒（New World arenavirus）和旧世界沙粒病毒（Old World arenavirus）两大复合群。其中，新世界B分支包含胡宁病毒（Junin virus, JUNV）、瓜纳里托病毒（Guanarito virus, GTOV）、萨比亚病毒（Sabia virus, SABV）、马丘波病毒（Machupo virus, MACV）和查帕雷病毒（Chapare virus, CHPV），它们均可引起南美出血热。旧世界沙粒病毒中，拉沙病毒（Lassa virus, LASV）在西非流行并引起人类病毒性出血热（viral hemorrhagic fever, VHF）。近年来，另一种旧世界沙粒病毒——卢霍病毒（Lujo virus, LUJV）被鉴定为高病死率（80%）VHF的新病原体。
由于致出血热沙粒病毒被多个国家归类为生物安全4级（biosafety level 4, BSL4）病原体，其活病毒操作受到严格限制，这严重阻碍了对这些病毒生命周期、致病机制以及治疗药物和疫苗的研究。为此，基于水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）或逆转录病毒的假型病毒（pseudotype virus）系统被开发出来，用于替代活病毒研究包膜蛋白介导的细胞入侵机制。本研究即在此背景下，构建了包含新发现的卢霍病毒（LUJV）和查帕雷病毒（CHPV）在内的多种沙粒病毒假型VSV（arenavirus pseudotype VSV, arepv），并重点分析LUJV包膜蛋白在细胞入侵、膜融合及受体利用方面的特征。
首先，作者通过化学合成获得了SABV、MACV、CHPV和LUJV的糖蛋白前体（glycoprotein precursor, GPC）cDNA，并通过合作者获得JUNV和LASV的GPC cDNA。将这些GPC基因克隆至表达载体pKS336中，构建了pKS-SABV-GP、pKS-MACV-GP、pKS-CHPV-GP、pKS-LUJV-GP、pKS-JUNV-GP和pKS-LASV-GP。同时，作者还构建了羧基端Flag/One-STrEP（FOS）标签融合蛋白表达载体，用于免疫印迹和免疫荧光检测。此外，作者构建了人转铁蛋白受体1（human transferrin receptor 1, hTfR1）表达质粒，用于后续受体依赖性实验。
假型VSV的制备方法为：将293T细胞培养至70%融合度，转染各沙粒病毒GPC表达质粒或VSV G蛋白表达质粒。转染24小时后，以G蛋白互补的VSVΔG/luc（*G-VSVΔG/luc）以0.1的感染复数（multiplicity of infection, MOI）感染细胞。该缺陷型VSV无自身包膜G蛋白，仅能从表达外源包膜蛋白的细胞出芽，形成携带外源包膜蛋白的假型病毒。感染24小时后收集培养上清，离心去除细胞碎片，-80°C保存。假型病毒的感染性通过荧光素酶活性（relative light unit, RLU）和聚焦形成单位（focus-forming units, FFU）进行定量。
在假型病毒表征方面，作者对FOS标签标记的LASV、JUNV、LUJV和CHPV的GPC及VSV-G蛋白进行了糖基化分析。细胞裂解物和纯化病毒粒子分别用内切糖苷酶H（endoglycosidase H, Endo H）和肽-N-糖苷酶F（peptide-N-glycosidase F, PNGase F）消化，经SDS-PAGE和免疫印迹检测。结果显示所有沙粒病毒GPC和病毒粒子中的G2亚基对Endo H和PNGase F均敏感，表明沙粒病毒包膜蛋白为高甘露糖型糖基化；而VSV-G则对Endo H抵抗、对PNGase F敏感，表明其糖链为复杂型或杂合型。
为评价假型病毒感染谱，作者将LASpv、JUNpv、LUJpv、CHPpv、SABpv和MACpv接种至多种哺乳动物细胞系，包括人源（Huh7、293T、HeLa、HepG2、Hep3B、Saos-2、U937、Raji、Molt-4、Jurkat）、猴源（VeroE6、COS7、Marc）、仓鼠源（BHK、CHO）、小鼠源（NIH 3T3、NMuLi、P388）及兔源（PK15）细胞。感染后24小时测定荧光素酶活性。针对LUJpv特异性，作者还使用抗LUJV-GP兔多克隆抗体进行中和实验，以证明LUJpv感染是由其包膜蛋白特异性介导的。
在内吞途径分析中，作者使用巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1）、氯化铵（ammonium chloride）和氯喹（chloroquine）预处理Huh7细胞，再感染假型病毒。通过比较不同抑制剂对病毒感染性的影响，判断病毒是否依赖内体酸化。
在受体利用分析中，作者采用抗hTfR1单克隆抗体预处理Huh7或U937细胞，或使用稳定表达hTfR1的CHO细胞（CHO/hTfR1），以及铁剂（ferric ammonium citrate, FAC）下调hTfR1表达，比较不同假型病毒的感染效率。对于β-肌营养不良聚糖（β-dystroglycan, βDG）依赖性，作者利用表达LARGE（一种乙酰氨基葡萄糖转移酶）的Raji和Jurkat细胞以及βDG敲除胚胎干细胞（DG knockout ES cells）进行感染实验。
在膜融合活性分析中，作者一方面通过免疫荧光和相差显微镜观察低pH处理下合胞体（syncytium）形成情况；另一方面利用T7 RNA聚合酶介导的定量细胞融合报告系统进行测定。具体方法为：293T细胞共转染沙粒病毒GPC表达质粒和T7 RNA聚合酶表达质粒，Huh7靶细胞转染含T7启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒，将两种细胞共培养后，用不同pH缓冲液处理2分钟，12小时后测定荧光素酶活性。
在脂质代谢与NPC1相关分析中，作者使用氯丙嗪（chlorpromazine）、丙咪嗪（imipramine）、地昔帕明（desipramine）、阿米替林（amitriptyline）和U18666A等药物预处理细胞，观察对假型病毒感染性的影响，并进一步使用野生型CHO（CHO/WT）、NPC1缺陷CHO突变株（CHO/A101）及表达Flag-NPC1的CHO/A101/NPC1-KI细胞，比较不同假型病毒的感染效率。
糖基化分析显示，LASV、JUNV、LUJV和CHPV的GPC在细胞内主要以未完全成熟的高甘露糖型存在，且病毒粒子中检测到的是经切割的G2亚基而非全长GPC，说明只有成熟的G1/G2被有效包装进假型病毒粒子。假型病毒感染滴度在Huh7和VeroE6细胞上均达到10⁷至5×10⁷ IU/ml以上，且荧光素酶活性与MOI呈正相关，表明假型病毒具有高度感染性。
在细胞感染谱方面，几乎所有测试细胞系均对arepv易感，其中COS7、Marc、Huh7、293T和HeLa细胞感染效率最高。但NIH 3T3、NMuLi和Molt-4细胞对LUJpv不敏感，Jurkat细胞对LASpv不敏感，P388细胞对所有arepv均不敏感。抗LUJV-GP抗血清能特异性和剂量依赖性地抑制LUJpv感染，而不影响LASpv和VSVpv，证明LUJpv感染具有严格的包膜蛋白特异性。
内吞途径实验显示，巴弗洛霉素A1、氯化铵和氯喹均能剂量依赖性地抑制所有arepv和VSVpv感染，而对MLVpv（pH非依赖性直接融合）无影响，证实arepv依赖pH依赖性内吞途径入侵。值得注意的是，LUJpv对低浓度氯喹极敏感，而CHPpv和SABpv在较高浓度下仅轻度受抑。
受体利用实验中，抗hTfR1抗体能显著抑制JUNpv、CHPpv、SABpv和MACpv在Huh7和U937细胞上的感染，而对LASpv、LUJpv和VSVpv无影响。CHO/hTfR1细胞对新世界B分支假型病毒的感染性较亲代CHO细胞显著提高，但对LASpv、LUJpv和VSVpv无增强作用。FAC处理可下调hTfR1并抑制JUNpv、CHPpv、SABpv和MACpv感染，但LASpv和VSVpv不受影响；有趣的是，LUJpv感染也被FAC抑制，这提示LUJV虽不利用hTfR1，但其受体可能受FAC处理影响。在βDG实验中，LARGE表达增加了Raji和Jurkat细胞对LASpv的易感性，但对JUNpv、LUJpv、CHPpv和VSVpv无影响。DG敲除ES细胞回补βDG后，仅LASpv感染显著增加，其他假型病毒感染无显著变化，说明LUJV既不依赖hTfR1也不依赖βDG。
在膜融合实验中，LASV-GP表达细胞在pH 4处理下出现合胞体，JUNV-GP和CHPV-GP表达细胞在pH 5以下出现合胞体，VSV-G表达细胞在pH 6以下即出现合胞体。但LUJV-GP表达细胞即使在pH 4处理下也未形成合胞体。定量细胞融合报告系统也得到一致结果：LASV-GP在pH 4以下、JUNV-GP和CHPV-GP在pH 5以下、VSV-G在pH 6以下诱导细胞融合，而LUJV-GP完全未检测到细胞融合活性。低pH直接处理假型病毒后，所有arepv的感染性均被消除，其中LASpv对低pH的敏感性相对较低，说明其构象变化需要更低pH或更长时间。
在脂代谢和NPC1相关实验中，氯丙嗪剂量依赖性地抑制所有arepv感染，但对LUJpv和LASpv的抑制作用显著强于其他arepv。丙咪嗪、地昔帕明和阿米替林均可显著抑制LUJpv和EBOVpv感染，对LASpv也有部分抑制。U18666A剂量依赖性地降低LUJpv和EBOVpv的感染性，但其他arepv受影响较小。在NPC1缺陷CHO/A101细胞中，LUJpv和EBOVpv感染显著下降，而在CHO/A101/NPC1-KI细胞中感染性恢复，表明LUJV高效感染需要NPC1活性。
本研究成功构建了含有不同沙粒病毒包膜蛋白的假型VSV，并首次系统分析了LUJV包膜蛋白在细胞入侵中的功能。研究发现LUJV既不利用βDG也不利用hTfR1作为受体，提示其可能利用一种未知受体。低pH处理不能诱导LUJV-GP介导的膜融合，说明其融合机制与其他沙粒病毒不同。此外，LUJpv感染对胆固醇转运抑制剂U18666A和NPC1缺陷细胞株表现出高度敏感性，表明NPC1活性或正常胆固醇/鞘脂代谢对LUJV高效入侵至关重要。这些结果对理解LUJV的致病机制、受体鉴定和抗病毒药物开发具有重要意义，尤其是氯喹等药物可能对LUJV感染具有潜在治疗价值。
本研究的创新点在于首次对LUJV包膜蛋白的细胞入侵特征进行了详细表征，发现其受体利用和膜融合机制均明显不同于已知沙粒病毒。此外，作者将假型VSV系统与多种已知和新发现的沙粒病毒包膜蛋白结合，为高致病性沙粒病毒的研究提供了安全、高效的替代工具。NPC1活性的需求以及FAC对LUJpv感染的特异性抑制作用为进一步鉴定LUJV受体和阐明其内吞后的膜融合机制提供了重要线索。