该研究由江南大学未来食品科学中心与生物技术学院的Yulong Xiang、Huawei Li、Jianghua Li、Guocheng Du、Jian Chen以及通讯作者Yang Wang共同完成。研究发表于国际期刊 《Biotechnology and Bioengineering》，于2026年1月16日投稿，同年4月13日正式接收，相关成果于2026年在线发表。研究经费主要来源于科技部国家重点研发计划（2024YFF1106800）和国家自然科学基金（32370079）。
N-糖基化（N-glycosylation）作为真核生物中最普遍也最复杂的翻译后修饰（post-translational modification, PTM）之一，广泛存在于超过半数的天然蛋白质中。糖基不仅可以作为空间屏障保护蛋白质免受蛋白酶降解和自由基损伤，从而显著提升其稳定性与半衰期，更能直接参与调控蛋白质的折叠、分泌、信号转导乃至催化功能。在蛋白酶家族中，糖基化修饰同样是普遍存在的现象，然而其如何从机制上影响酶活性的具体机理，在此前的研究中仍较为匮乏。
人肠激酶轻链（human light-chain enteropeptidase, hLEK）是一种II型丝氨酸蛋白酶，其最显著的生化特征在于能够特异性识别四天冬氨酸-赖氨酸（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, D4K）基序，并在赖氨酸残基的C端进行精确切割。这一独特性质使其在生物技术与生物制药领域，特别是重组融合蛋白标签的精准切除工艺中，具有不可替代的广泛应用价值。然而，尽管牛和其他哺乳动物来源的肠激酶已被证实存在广泛的N-糖基化修饰，且已有研究表明去糖基化会影响其酶学活性及三级结构，但天然N-糖基化修饰调控该酶催化活性的具体分子机制始终未被阐明。
在重组表达方面，此前的研究多集中于大肠杆菌（*E. coli*）、酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）和毕赤酵母（*Pichia pastoris*）等宿主体系，但普遍面临表达量低和/或酶活性低下的双重瓶颈。因此，该研究旨在通过定点去糖基化工程，系统性地剖析四个N-糖基化位点对hLEK催化特性的差异化影响，并结合分子动力学模拟（Molecular Dynamics simulation）和蛋白质残基动力学网络（Protein Residue Dynamical Network, PRDN）分析，深入揭示糖基化影响催化活性的变构通讯机制。最终，通过整合稳定性设计（ΔΔG指导）与糖基化重构策略，获得在毕赤酵母中高产、高活性的hLEK突变体，为工业规模应用奠定基础。
研究团队首先基于人肠激酶轻链的氨基酸序列（UniProt ID: P98073）进行密码子优化与基因合成，将其克隆至毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K中，成功构建了重组质粒pPIC9K-hLEK。利用NetNGlyc 1.0软件预测，hLEK上存在四个潜在的N-糖基化位点：Asn64、Asn103、Asn125和Asn165。为探究各糖基化位点的功能，研究者通过反向PCR介导的定点突变，将这些Asn密码子依次单点或组合突变为Gln（谷氨酰胺），系统性地构建了包含四个单点突变体、六个双点突变体、四个三点突变体以及一个完全去糖基化的四点突变体（N64Q/N103Q/N125Q/N165Q）在内的庞大突变体文库。所有线形化质粒均以电穿孔法转化入P. pastoris GS115菌株，经G418抗性筛选获得高拷贝重组子。
各重组菌株采用标准的两阶段发酵策略在摇瓶规模进行诱导表达：首先在甘油相（BMGY培养基）积累生物量，随后置换至甲醇相（BMMY培养基）持续诱导96小时以启动AOX1启动子驱动的蛋白表达，期间每24小时补加1%（v/v）的纯甲醇。表达上清液经Ni-NTA亲和层析纯化，使用Bradford法测定蛋白浓度，并通过SDS-PAGE电泳分析蛋白表观分子量。
为确证N-糖基化的存在，纯化后的重组野生型hLEK经内切糖苷酶H（Endo H）于37°C消化3小时，以切除高甘露糖型N-聚糖。结果显示，未处理的hLEK在SDS-PAGE上呈现为显著高于理论分子量（27 kDa）的弥散条带，而Endo H处理后条带坍缩为单一锐利条带，证实了蛋白在毕赤酵母中发生了高度异质性的N-糖基化修饰。针对完全去糖基化突变体及后续设计的稳定性增强突变体，研究还联用了轨道阱Eclipse Tribrid质谱仪进行完整质量分析，肽段覆盖率高达74.9%-95.3%，确证了突变序列的保真性。
酶活测定体系以人工合成底物Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-萘酰胺（GD4K-NA）为核心，于37°C、pH 8.4条件下，通过多功能酶标仪以连续荧光法（激发337 nm，发射420 nm）监测酶切产物β-萘酰胺的释放速率，以此计算酶活力单位（U）。为深入解析活性变化的根源，实验测定了七个不同底物浓度（0.05-1.00 mM）下的反应初速度，采用Origin 2022软件依据米氏方程非线性拟合，精确求解了所有突变体的米氏常数（Km）和催化转换数（kcat）等关键动力学参数。
为揭示糖基化调控催化活性的别构机制，该研究采用了先进的计算生物学流程。首先，利用Chai-1和Rosetta FastRelax进行底物-蛋白复合物结构建模与系综构象采样，并通过AutoDock Vina获取最佳对接构象。以此为初始结构，利用CHARMM-GUI Glycan Reader & Modeler模块添加均一的高甘露糖型N-聚糖模型。针对不同糖基化状态的多个突变体体系，采用GROMACS软件和CHARMM36力场，在310.15 K和生理离子强度下进行了总时长不少于1500纳秒的三次独立重复分子动力学模拟，共获取了超过15000帧轨迹快照。
为量化远端糖基化与活性中心间的动态信息传递，研究应用了加权次优路径实现（Weighted Implementation of Suboptimal Paths, WISP）软件进行蛋白质残基动力学网络（PRDN）分析。该方法首先基于动力学互相关矩阵构建以残基为节点、以运动相关性为边权的残基接触网络。随后，将糖基化残基定义为“源”（source），催化三联体残基（His41, Asp92, Ser187）定义为“汇”（sink），计算了每条边权重下源汇之间的20条最短及次优的信号传递路径（signal-transmission paths），并对其长度分布进行了统计分析。
为解决全去糖基化四点突变体表达量锐减的问题，研究采用了PROSS（Protein Repair One Stop Shop）网页服务器进行稳定性工程设计。该平台通过多序列比对生成位置特异性打分矩阵，并结合Rosetta原子级ΔΔG（折叠自由能变）扫描，在不触动催化中心及底物结合位点周围7Å范围内氨基酸的前提下，对蛋白质表面进行组合稳定性突变设计。研究者从PROSS产出的9个设计方案中随机选取了5个（命名为P2, P5, P6, P7, P9），以全去糖基化突变体为骨架，在毕赤酵母中表征了它们的表达水平和比酶活。
在获得表达量大幅提升但活力降低的P6突变体后，研究关键性地实施了糖基化理性重构策略。基于前期PRDN网络分析的机制洞察，即103和165号位的糖基化能缩短信号传递路径，研究者在P6突变体骨架上，通过反向突变Gln为Asn，重建了这两个位点的单点和双点N-糖基化修饰，构建了P6_Q103N、P6_Q165N和P6_Q103N/Q165N三个重构突变体。
单点突变实验首次揭示了N-糖基化对hLEK活性的影响具有高度位点依赖性。与野生型相比，N64Q和N125Q突变体的比酶活显著升高，而N103Q轻微下降，N165Q则显著下降。动力学数据清晰地指明了活性变化的来源：所有突变对Km影响甚微，却极大程度地改变了kcat。例如，N125Q的kcat提高了近5.9倍，而N165Q则降低了1.4倍。这表明糖基化不干涉底物结合，而是直接调控催化转化效率，其效果可能是正向或负向的，取决于具体位点。这一发现打破了“糖基化仅起保护作用”的传统认知，暗示了其可能参与活性中心的远程动态调控。
组合突变的结果进一步支持了这一假说。N64Q/N125Q双突变体的比酶活较野生型提升了约15倍，呈现出强烈的协同增效作用；而N103Q/N165Q双突变体的比酶活则降至野生型以下。然而，当所有四个位点均被移除后（N64Q/N103Q/N125Q/N165Q），尽管SDS-PAGE与质谱分析确认了蛋白的完全去糖基化状态，其表达量却锐减至野生型的约0.8倍，总活力因此大幅下降，构成了后期工程改造的直接原因。
这是本研究的核心理论贡献。通过PRDN分析对比去糖基化与糖基化的突变体对，研究者发现了一个一致性规律：当Asn103或Asn165位点携带聚糖时，从该糖基化位点到催化三联体（His41, Asp92, Ser187）的动态信号传递路径长度的统计分布显著缩短。这表明聚糖的存在优化了蛋白质内部的振动-能量传递网络，使得源自远端糖基的信号能够更高效地“流向”活性中心。这一结果为观测到的kcat升高提供了瞬时的、物理的机制解释，即N-糖基化通过增强别构通讯，降低了催化步骤的能垒，从而加速了催化转换。
ΔΔG指导的PROSS设计成功解决了表达瓶颈。在筛选的五个突变体中，P6突变体的表达量高达163.79 mg/L，是全去糖基化突变体的76.5倍。然而，伴随着稳定性的提升，所有设计突变体的比酶活和kcat显著降低，呈现出典型的“稳定性-活性”权衡（stability-activity trade-off）效应。
机制指导的糖基化重构成功打破了这一权衡。在P6骨架上重新引入Asn103和/或Asn165位点的N-糖基化后，表达量几乎不受影响，而比酶活则恢复了最低约1.9倍、最高约2.7倍的提升。随后的PRDN分析再次确认，重新糖基化的突变体同样表现出信号传递路径缩短与kcat升高的正相关性。最终，结合了高表达骨架与激活性糖基修饰的组合突变体P6_Q103N/Q165N实现了最高的总酶活输出。在5-L发酵罐补料分批发酵验证中，该突变体在甲醇诱导168小时时达到总酶活峰值5.86×10⁶ U/L，折合蛋白浓度高达358 mg/L，产酶水平是此前报道最高水平的4倍。
本研究系统性地论证了远端N-糖基化可以通过重塑蛋白质内部残基相互作用网络，作为一种有效的别构调控机制，在无明显构象变化的情况下加速人肠激酶的催化转化速率（kcat）。其科学价值在于，首次将糖基化修饰与蛋白质的动态网络通讯联系起来，建立了“聚糖附着-信号路径缩短-催化效率提升”这一清晰的因果链，为理解糖基化调控蛋白质功能的复杂机制提供了全新的视角。
在应用价值层面，该研究开创性地提出了将“N-糖基化机制的深入洞察”与“ΔΔG指导的稳定性设计”相结合的工程策略。通过先获得高表达骨架，再理性重构具有别构激活效应的关键N-糖基化位点，成功实现了高产率与高活性的兼顾，获得的毕赤酵母重组菌株补料分批发酵产酶水平已达工业化应用标准。这一方法论不仅为肠激酶的高效生产开辟了道路，也为其他糖基化工业酶的理性设计确立了可执行的成功范例。
本研究的亮点主要集中在三个层面。首先，科学发现的新颖性：揭示了N-糖基化调控酶活性的全新别构机制，明确了其通过缩短蛋白质内部动态信号传递路径来提高催化转换数（kcat），而不是传统认知中的改变底物结合（Km）。其次，方法学的整合创新：成功将WISP算法的PRDN分析应用于揭示糖基化的动态别构效应，为研究翻译后修饰与蛋白质功能的关联提供了高分辨率的计算工具。最后，工程策略的独创性：提出了“稳定性提升以增加表达→理性重构功能糖基化以恢复/增强活性”的理性设计闭环，完美解决了蛋白工程中常见的“稳定-活性”难以兼得的难题，实现了工业属性（高产量）与功能属性（高活性）的统一。