类型b

这篇论文由Edward C. Stack、Chichung Wang、Kristin A. Roman和Clifford C. Hoyt（PerkinElmer公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）撰写，于2014年在《Methods》期刊上发表。文章主要探讨了多重免疫组化（Multiplexed Immunohistochemistry, mIHC）、成像和定量分析的最新进展，并特别评估了酪胺信号放大（Tyramide Signal Amplification, TSA）、多光谱成像（Multispectral Imaging）以及多重分析技术的应用。

学术背景

多重免疫组化是一种在单个组织切片中同时检测多个标记物的技术，对于理解疾病异质性和细胞生物学机制至关重要。传统病理学实践中，染色方法通常基于视觉分析一到两种蛋白质或少量DNA/RNA分子，这限制了信息获取的广度和深度。随着个性化医疗的发展，需要更全面的方法来捕获复杂的生物数据。因此，作者旨在通过新的多色免疫组化方法、自动化的多光谱幻灯片成像和高级可训练模式识别软件，提供一种综合性的解决方案。

主要观点及支持证据

多重染色方法

文章详细介绍了明场和荧光mIHC的不同策略及其优缺点。例如，明场mIHC使用各种酶/显色剂对来区分不同类型的细胞，但难以共定位目标。相比之下，荧光mIHC利用不同波长的发射光，在黑暗背景下更容易实现多路复用。然而，荧光mIHC也面临自体荧光干扰等问题。为解决这些问题，作者提到了酪胺信号放大（TSA）技术，该技术通过共价结合信号显著提高了相似物种抗体的荧光mIHC效果，并提供了定量且可重复的数据。

支持证据： - Mason等人展示了FFPE扁桃体组织中的2重荧光IHC。 - Bogusz等人研究了弥漫性大B细胞淋巴瘤中的活性BCR信号传导，使用了不同的2重组合。 - 使用量子点进行4重荧光IHC成功揭示了胃癌肿瘤微环境。

成像方法与系统

文章讨论了几种成像方法，包括连续切片法（Serial Sectioning）、层状膜提取法（L-IHC）和多光谱成像。尽管这些方法各有优势，但它们都无法充分捕捉真正的mIHC潜力，即在同一部分中询问多个标记并完全保留组织上下文。多光谱成像被认为是克服这一限制的关键技术。

支持证据： - Pauly等人使用光谱CLSM成功分析了吸烟者新鲜肺组织中的自体荧光巨噬细胞。 - Fountaine等人通过顺序IHC和光谱CLSM检测了扁桃体中的CD20、IgD、MIB-1、CD3和CD68表达。

软件分析

为了有效分析捕获的图像，必须能够从图像中提取荧光或显色强度信息。文中提到几种图像分析软件包，如Inform、Definiens和Precision，这些软件可以支持mIHC分析。特别是Inform软件，可以通过线性解混提取每个荧光靶标的强度，从而实现精确的定量。

支持证据： - 在兔肝组织中，使用Inform软件成功解析了3重IHC面板（细胞角蛋白、CD31和Ki67）。 - Gerdes等人通过迭代染色实现了超过60个目标的显著多路复用。

病理工作流程中的整合

文章强调了将多重染色和多光谱成像整合到病理工作流程中的重要性。自动化组织分割、模拟亮场视图和系统培训等技术可以大大提升病理学家的工作效率和准确性。

支持证据： - 自动化组织分割减少了手动注释和评分的时间。 - 模拟H&E和DAB染色图像增强了复杂多路复用染色模式的理解。

论文的意义和价值

本文通过对mIHC、成像和定量分析的全面回顾，为研究人员提供了宝贵的参考资料。它不仅概述了当前的染色方法和成像方式，还评估了一种实用的mIHC应用——使用TSA简化mIHC测定。研究表明，Opal方法结合多光谱图像分析可以提供高度量化的数据，允许更离散的病理评估。此外，该方法具有高度的可重复性，表明其稳定性和适用性，为临床实验室改进修正案（CLIA）或实验室开发测试（LDT）要求提供了良好的基础。最终，这种方法有望推动个性化医疗的发展，改善临床护理质量。