该研究由Jusung An和Kyeonghwan Kim为共同第一作者，Jong Seung Kim、Kun Ho Lee和Youngsoo Kim为共同通讯作者，团队成员来自韩国高丽大学、延世大学、朝鲜大学以及澳大利亚阿尔弗雷德医院等多个机构。该研究成果于2024年发表在《自然·通讯》（*Nature Communications*）期刊上。
这项研究属于生物医学工程与神经科学交叉领域，聚焦于阿尔茨海默病的早期诊断。阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是最常见的痴呆症类型。根据淀粉样蛋白级联假说，β-淀粉样蛋白（Amyloid-β， Aβ）的聚集，特别是其寡聚体形式，被认为是AD病理发生的关键早期事件和主要驱动因素。与不溶性Aβ纤维斑块相比，可溶性的Aβ寡聚体被认为在引发突触毒性、炎症、tau蛋白过度磷酸化以及最终导致神经元死亡和认知障碍方面，具有更强的神经毒性，并且与临床症状的相关性更密切。然而，由于Aβ寡聚体在生理条件下结构异质、不稳定且在生物体液中含量极低，对其进行特异性检测面临巨大技术挑战。目前的临床诊断方法（如认知评估问卷、正电子发射断层扫描等）往往在疾病已显著进展时才能做出判断，无法满足早期诊断的需求。因此，开发一种能够灵敏、特异地检测生物体液中Aβ寡聚体的方法，对于AD的早期诊断、病理监测和治疗干预具有至关重要的意义。本研究的目标是设计并开发一种新型荧光探针，能够特异性识别Aβ寡聚体，并最终将其应用于分析患者脑脊液，以实现AD（特别是其早期阶段）的体外诊断。
本研究包含探针设计合成与表征、体外Aβ聚集动力学监测、探针-靶标相互作用机制研究、生物组织成像验证以及临床脑脊液样本应用评估等多个详细环节。
首先，研究团队基于理性设计策略，成功合成了一种名为喹啉衍生的半姜黄素-二氧杂硼烷（quinoline-derived half-curcumin-dioxaborine, Q-OB）的荧光探针。其设计思路如下：（1）采用N,N-二甲基喹啉胺作为电子供体（Donor），以增强与Aβ寡聚体之间潜在的氢键相互作用和疏水性结合；（2）使用二氧杂硼烷基半姜黄素作为电子受体（Acceptor），与供体部分构成“供体-π桥-受体”（D-π-A）结构，赋予分子显著的分子内电荷转移特性，使其荧光对环境极性高度敏感；（3）在分子中引入异丁基，以抑制分子间π-π堆积，提高探针在水溶液中的溶解度和光稳定性。合成路线涉及锂-卤素交换反应和原位醛醇缩合，最终以33.6%的总收率获得目标化合物。光物理表征显示，Q-OB具有大的斯托克斯位移（约110纳米），其荧光量子产率在非极性环境中很高，而在极性水环境中较低，这种“荧光开启”特性使其非常适合用于探测Aβ聚集过程中形成的疏水性微环境。
其次，研究团队系统地评估了Q-OB在体外监测Aβ1-42自组装动力学的能力。他们采用了两种实验方案：“分离孵育”和“共孵育”。在“分离孵育”实验中，预先让Aβ1-42在缓冲液中自组装不同时间，再分别加入Q-OB进行荧光检测。结果表明，Q-OB的荧光强度在Aβ聚集的早期（2小时内）迅速升高，随后随着成熟纤维的形成（72小时）而下降。相比之下，传统的硫黄素T（Thioflavin T, ThT）主要结合富含β-折叠的成熟纤维，其荧光信号在6小时后才持续缓慢上升。这表明Q-OB对Aβ寡聚体形成过程中的中间态具有响应。在“共孵育”实验中，将Q-OB与Aβ1-42单体混合，实时监测荧光变化。结果显示，Q-OB的荧光信号出现一个尖锐的峰值，该峰值对应寡聚体形成的动力学过程，之后信号衰减。改变孵育温度（20°C, 37°C, 50°C）可以显著影响该峰出现的时间，温度越高，峰值出现越早，这与Aβ聚集的成核速率依赖于温度的理论相符，进一步证明了Q-OB信号与Aβ寡聚化动力学的关联。透射电子显微镜和圆二色光谱证实了不同孵育时间点对应的Aβ物种形态（随机卷曲的单体/寡聚体、β-折叠的纤维）与Q-OB的荧光响应模式相匹配。
第三，为了阐明Q-OB对Aβ寡聚体的特异性和亲和力，研究人员进行了一系列深入的相互作用研究。竞争性结合实验显示，Q-OB对Aβ1-42寡聚体的荧光增强效应最为显著，与Aβ单体或纤维相比，增强倍数高出2.5到100倍以上。荧光滴定实验测得Q-OB与Aβ1-42寡聚体的解离常数（Kd）为302.63 ± 94.75 nM，显示出良好的结合亲和力；而对单体和纤维的亲和力则弱得多（Kd值在微摩尔级别）。检测限计算表明，Q-OB对Aβ1-42寡聚体的检测灵敏度高达0.57 ± 0.04 nM。为了确定结合位点，研究采用了片段映射分析。将Aβ1-42的全长序列分解为一系列重叠的六肽片段固定于板子上，然后与Q-OB孵育。结果显示，Q-OB主要与位于中央疏水核心区（第14-21位氨基酸，序列HHQKLVFF）和C末端疏水区（第37-42位氨基酸，序列VVIA）的肽段结合。这两个区域正是Aβ聚集的关键区域。此外，通过使用100 kDa分子量截留滤器对Aβ寡聚体混合物进行分级，发现Q-OB的荧光信号主要来源于大于100 kDa的高分子量寡聚体（超过22聚体），这进一步明确了其识别的目标寡聚体范围。
第四，研究团队在多个生物模型上验证了Q-OB的成像能力。在5xFAD转基因AD模型小鼠的脑组织切片中，Q-OB能够清晰地标记出细胞外的淀粉样斑块，其染色模式与抗Aβ抗体（6E10）的染色高度共定位，表明Q-OB可以有效地与脑组织中的Aβ聚集体结合。同时，在对AD患者尸检获得的脑海马组织切片进行染色时，Q-OB同样成功标记出了老年斑。这些结果证明了Q-OB在复杂生物组织中识别Aβ聚集体的能力。此外，体外细胞毒性实验显示Q-OB对神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y）的毒性可忽略不计，且具有出色的光稳定性。平行人工膜渗透性试验和计算预测均表明Q-OB具有良好的血脑屏障穿透潜力。基于此，研究者在活体5xFAD转基因小鼠上进行了初步的体内光学成像实验。静脉注射Q-OB后，利用活体成像系统监测脑部荧光信号。结果显示，13.5月龄（高Aβ负荷）AD模型小鼠脑部的荧光信号强度显著高于3月龄（低Aβ负荷）AD模型小鼠和野生型对照小鼠，表明Q-OB能够在一定程度上反映脑内Aβ沉积的水平。
第五，也是本研究的核心应用环节，是将Q-OB应用于AD患者脑脊液的体外诊断分析。研究共纳入了61名受试者的脑脊液样本，根据临床诊断和生物标志物水平分为认知正常组（CN，22人）、轻度认知障碍组（MCI，21人）和阿尔茨海默病痴呆组（ADD，18人）。研究人员设计了一种“Q-OB检测法”：在患者的脑脊液样本中外源性地加入Aβ1-42单体，然后加入Q-OB探针，在37°C下进行共孵育并实时监测荧光变化2小时。他们计算了孵育2小时与初始时刻的荧光强度比值的对数，即log(I/I0)。结果发现，三组之间的log(I/I0)值存在显著差异：CN组为0.34 ± 0.13，而MCI组和ADD组分别为0.15 ± 0.12和0.14 ± 0.10。这一结果表明，Q-OB检测法能够有效地区分认知正常的个体与处于AD连续谱早期（MCI）或痴呆期（ADD）的个体。尽管MCI和ADD组之间的值没有显著差异，但能够从CN中区分出病理状态已是早期诊断的关键一步。进一步分析显示，Q-OB检测得到的log(I/I0)值与脑脊液中传统AD生物标志物的浓度具有显著相关性：与Aβ1-42水平呈正相关，与磷酸化Tau（p-tau181）和神经丝轻链（NFL）水平呈负相关。这些数据与商业化的免疫测定法（如Lumipulse和Innobia Alzbio3 xMAP）的结果趋势一致，证明了Q-OB检测法的可靠性。
本研究的主要结论是：成功开发了一种名为Q-OB的新型小分子荧光探针，该探针能够以高亲和力和高选择性特异性检测Aβ寡聚体，尤其是在Aβ自组装动力学早期出现的高分子量寡聚体。Q-OB不仅能在体外实时监测Aβ聚集过程，还能对AD模型小鼠和患者脑组织中的Aβ斑块进行成像。更重要的是，将其应用于患者脑脊液样本的荧光动力学分析，可以区分认知正常个体与AD病理早期个体，展现出作为AD早期体外诊断工具的潜力。这项研究在科学价值上，为理解Aβ寡聚体的检测提供了新的分子工具和机制见解（如明确了其结合的关键疏水位点）；在应用价值上，为开发低成本、快速、便捷的AD早期诊断方法开辟了新路径，有望弥补现有临床诊断方法的不足，助力于AD的早期干预和治疗策略的制定。
本研究的亮点和创新性在于：第一， 探针设计的理性与创新：通过精细调控疏水性，将喹啉环引入半姜黄素骨架，创造性地优化了探针对Aβ寡聚体的特异性识别能力，而非传统上针对纤维的设计。第二， 动态过程监测能力：Q-OB能够实时、灵敏地反映Aβ自组装过程中寡聚体形成的动力学变化，这是许多现有探针无法实现的。第三， 明确的靶标识别机制：通过片段映射和分子量截留实验，清晰地揭示了Q-OB与Aβ中央及C末端疏水区域的结合，并明确了其倾向于识别大于100 kDa的高分子量寡聚体。第四， 成功的临床转化探索：这是首次将小分子荧光探针直接应用于AD患者脑脊液样本，并建立了与疾病状态相关的定量荧光检测指标（log(I/I0)），实现了从基础研究到临床诊断应用的跨越，为开发新型诊断平台提供了概念验证。第五， 多层面验证体系：研究从分子水平（结合亲和力、特异性）、细胞组织水平（脑切片成像、生物相容性）到整体动物水平（活体成像）和最终临床样本水平，构建了完整而严谨的证据链，充分证明了Q-OB的有效性和应用前景。