人类脂肪源性成体干细胞（hADAS细胞）的生物学特性及供体年龄对细胞增殖的影响研究

作者及发表信息
本研究由Lei Lei、Liao Weiming（通讯作者）、Sheng Puyi、Fu Ming、He Aishan及Huang Gang合作完成，团队成员均来自中山大学附属第一医院骨科。研究成果发表于2007年6月的《Science in China Series C: Life Sciences》（中国科学C辑：生命科学），卷50期3，页码320-328，由科学出版社与Springer-Verlag联合出版。

学术背景
研究领域与动机
hADAS细胞（human adipose-derived adult stem cells）作为组织工程的新型种子细胞，具有多向分化潜能，但其增殖活性与供体年龄的关系尚未明确。脂肪组织来源的干细胞因其易获取性、高产量（约40万细胞/mL脂肪抽吸物）及低伦理争议性，成为骨髓间充质干细胞（MSCs）的潜在替代来源。然而，年龄对hADAS细胞增殖能力的影响可能限制其在老年患者中的应用。本研究旨在揭示供体年龄对hADAS细胞体外增殖活性的影响，并评估其作为组织工程种子细胞的可行性。

关键科学问题
既往研究表明，大鼠脂肪前体细胞的增殖速率随年龄增长下降，但人类hADAS细胞的年龄依赖性尚未系统研究。此外，hADAS细胞的表面标志物表达（如CD49d、CD106）存在争议，需进一步验证。

研究流程与方法
1. 样本采集与分组
从20名男性供体的下肢皮下脂肪组织中获取约10g脂肪，按年龄分为4组：<20岁（青少年）、21–40岁（青年）、41–60岁（中年）、>61岁（老年），每组5例。样本经PBS清洗后，采用I型胶原酶（1g/L）37℃消化60分钟，离心获取基质血管组分（SVF），接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。

2. 细胞培养与传代
原代细胞（P0）培养4–5天至融合，非贴壁细胞（如红细胞）通过换液去除。细胞以胰蛋白酶消化传代，选取第3代（P3）细胞进行增殖实验，第10代（P10）用于细胞周期分析，第20代（P20）用于核型稳定性检测。

3. 表面标志物检测
通过流式细胞术（FCM）分析hADAS细胞的标志物表达：CD29（85.7%阳性）、CD44（53%阳性）、CD34/CD45/CD106/HLA-DR（阴性），CD49d（12.6%弱阳性）。采用FITC/PE标记抗体，以非特异性IgG为对照。

4. 细胞周期与核型分析
P10细胞经乙醇固定后，流式检测显示G1期占比89.23%±2.83%。P20细胞通过秋水仙素阻滞、低渗处理和吉姆萨显带，证实染色体数目与结构正常，无异常核型。

5. 增殖动力学分析（MTT法）
将P3细胞以2×10³/孔接种96孔板，每12–84小时检测OD490值。利用公式 ( TD = \frac{t \log 2}{\log N_t - \log N_0} ) 计算倍增时间（TD）。数据经SPSS 13.0进行ANOVA分析，组间比较采用Student-Newman-Keuls法。

主要结果
1. 细胞形态与表面标志物
hADAS细胞呈梭形或星形，传代后形态均一（图1）。流式结果与文献部分一致，但CD49d表达较低（±），CD106为阴性，区别于骨髓MSCs（CD106+）。

2. 增殖能力与年龄相关性
- TD时间：青少年组（11.22±0.73小时）显著低于老年组（13.11±0.83小时）（p=0.002）。
- 生长曲线显示，对数生长期为12–60小时，老年组OD值显著低于青少年组（表4）。ANOVA分析证实年龄对TD有显著影响（F=7.379，p<0.05）。

3. 遗传稳定性
P20细胞核型分析显示二倍体正常，证实长期培养中遗传稳定性。

结论与价值
科学意义
本研究首次系统证明hADAS细胞的增殖活性与供体年龄负相关，青少年来源的细胞具有更强的增殖能力。这一发现为组织工程中种子细胞的选择提供了年龄维度的依据。

应用价值
hADAS细胞因其易获取、高增殖和多向分化潜能，成为修复骨/软骨缺损的理想候选。然而，老年患者的细胞增殖能力下降可能影响治疗效果，需通过优化培养条件或年轻供体细胞库解决。

研究亮点
1. 年龄依赖性验证：首次通过多年龄分组（青少年至老年）量化hADAS细胞的TD差异，填补了人类脂肪干细胞年龄相关研究的空白。
2. 方法创新：采用皮下脂肪切割法替代传统吸脂术，减少血液污染，提高细胞纯度。
3. 争议性标志物澄清：CD106阴性结果支持hADAS细胞与骨髓MSCs的差异，为细胞鉴定提供新证据。

其他价值
研究团队开发的核型稳定性检测流程（至P20）为长期培养的安全性评估提供了可靠方案，支持后续临床转化研究。