针对干眼症治疗的新型纳米药物递送平台：基于迷迭香酸自聚合的硫醇化纳米颗粒的构建与评估
一、 研究团队与发表信息
本项研究由来自上海交通大学药学院、浙江大学医学院附属第二医院眼科中心及上海市第六人民医院的科研人员合作完成。主要作者包括Zixin Wang、Zeen Lv、Yuxuang E、Ruiyang Xue、Fang Wu、Haijie Han和Yin Wang。该研究成果以“Self-polymerized polyphenol-based platform for the management of dry eye pathogenesis”为题，于2026年发表于学术期刊 *Nature Communications*（2026年，第17卷，文章号：4132）。
二、 学术背景与研究目标
科学领域： 本研究属于生物医学工程、纳米医学和眼科学交叉领域，聚焦于开发新型药物递送系统和治疗策略，用于治疗慢性炎症性疾病，特别是干眼症。
研究背景与动机： 干眼症是一种全球性的健康问题，其特征是泪液分泌不足和持续的炎症反应，严重影响患者生活质量。传统治疗方法，如人工泪液和抗炎滴眼液（如环孢素A），存在局限性：疗效短暂且部分，药物因泪液快速清除而需频繁给药，且眼表屏障（如黏液层）阻碍药物渗透。干眼症的病理机制涉及氧化应激与炎症的恶性循环，包括高渗透压、氧化损伤、炎症和细胞凋亡。因此，亟需开发能够长效滞留于眼表、同时具备抗氧化和抗炎双重功能的治疗平台。
天然多酚类化合物（如迷迭香酸）因其酚羟基和共轭结构，具有出色的活性氧清除和抗炎特性。然而，其临床应用面临挑战：水溶性差，以及小分子酚类化合物的酚基团含量有限导致抗氧化能力受限。此外，虽然多巴胺聚合已较为成熟，但利用天然酚类通过化学聚合制备纳米多酚的研究尚不充分。
研究目标： 本研究旨在设计并构建一种基于多酚的人工纳米平台，用于干眼症的综合治疗。具体目标包括：1）开发一种简便的、基于天然多酚自聚合的策略，制备具有良好抗氧化和抗炎性能的纳米颗粒；2）通过表面修饰（如硫醇化）增强纳米颗粒在眼表的黏液黏附能力，延长滞留时间；3）在体外和体内模型中系统评估该纳米平台的抗氧化、抗炎、促进角膜上皮修复和恢复泪液分泌的综合疗效；4）评估其生物安全性。
三、 详细研究流程
本研究包含多个相互关联的实验阶段，流程严谨且系统。
第一阶段：纳米颗粒的设计、合成与表征 1. 纳米颗粒的构建： 研究人员首先利用高碘酸钠氧化聚合迷迭香酸，形成聚合迷迭香酸。然而，无模板聚合产物不稳定且不均匀。为解决此问题，他们在聚合体系中引入透明质酸作为稳定剂，随后与铈离子共组装，形成单分散的纳米颗粒，命名为RHC NPs。为进一步增强其在眼表黏液层的滞留，通过缩合反应将巯基修饰到RHC NPs表面，得到硫醇化纳米颗粒（S-RHC NPs）。设计了三种不同巯基含量（0%， 3.4%， 4.7%， 8.2%）的NPs，分别命名为RHC， S1-RHC， S2-RHC和S3-RHC。 2. 表征方法： 采用傅里叶变换红外光谱、紫外-可见光谱、透射电子显微镜、动态光散射、Zeta电位分析、X射线光电子能谱等手段对纳米颗粒的化学结构、形貌、尺寸、元素组成和价态进行了全面表征。通过Bradford蛋白测定法评估了NPs与黏蛋白的结合能力。利用纳米颗粒追踪分析技术分析了NPs在黏蛋白溶液中的运动轨迹和扩散系数。 3. 抗氧化性能评估： 通过ABTS自由基清除实验、亚甲基蓝实验（检测羟基自由基清除能力）和铁还原抗氧化能力实验，评估了NPs的总抗氧化活性。并观察了NPs在过氧化氢刺激下的形态变化。
第二阶段：体外细胞实验评估生物活性 1. 细胞模型： 使用人角膜上皮细胞（HCECs）和鼠巨噬细胞（RAW264.7）作为体外模型。 2. 黏液黏附与细胞摄取机制： 建立HCECs单层Transwell模型模拟眼表，研究S-RHC NPs与黏液相互作用后的细胞摄取行为。使用氯丙嗪（网格蛋白介导的内吞抑制剂）、阿米洛利（巨胞饮抑制剂）和染料木黄酮（小窝蛋白介导的内吞抑制剂）探究NPs进入HCECs和RAW264.7细胞的主要途径。 3. 抗氧化与细胞保护作用： * 活性氧清除： 用过氧化氢刺激HCECs产生氧化应激，使用DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平，评估NPs的清除能力。 * 细胞活力与凋亡： 通过CCK-8实验检测NPs对过氧化氢或高渗压力诱导的细胞死亡的缓解作用。使用流式细胞术（Annexin V-FITC/PI染色）定量分析细胞凋亡。 * 氧化损伤标志物： 检测丙二醛（MDA，脂质过氧化产物）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性。 * 转录组与蛋白质组学分析： 对经S-RHC NPs处理的HCECs进行RNA测序和蛋白质组学分析，探究NPs调控的氧化应激和炎症相关信号通路（如p53、IL-17信号通路），并进行基因集富集分析和基因本体论注释。 * DNA损伤保护： 通过免疫荧光检测DNA双链断裂标志物γ-H2A.X的焦点形成，评估NPs对氧化应激诱导的DNA损伤的保护作用。 4. 抗炎与巨噬细胞复极化作用： * 用脂多糖（LPS）刺激RAW264.7细胞诱导其向促炎的M1表型极化。 * 表型转换： 通过鬼笔环肽染色观察细胞形态变化（从多伪足不规则形变为纺锤形）。使用流式细胞术（CD86和CD206标记）定量分析M1和M2表型巨噬细胞的比例。 * 细胞因子分泌： 使用酶联免疫吸附测定法检测培养上清中促炎因子（TNF-α， IL-6）和抗炎因子（TGF-β）的水平。 * 标志物表达： 通过免疫荧光染色检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS， M1标志）和精氨酸酶-1（Arg1， M2标志）的表达。使用Griess法检测一氧化氮的生成。 * 细胞内ROS水平： 评估LPS刺激本身对巨噬细胞氧化应激的影响，以及NPs的缓解作用。
第三阶段：体内动物模型疗效验证 1. 动物模型： 使用两种不同机制诱导的C57BL/6J小鼠干眼症模型：① 蒸发过强型干眼模型： 通过局部滴加苯扎氯铵（BAK）7天建立；② 水液缺乏型干眼模型： 通过腹腔注射东莨菪碱（Scop）7天建立。 2. 分组与给药： 将建模后的小鼠随机分为多组，分别给予生理盐水、游离迷迭香酸、游离铈离子、RHC NPs、S-RHC NPs以及临床阳性对照药Restasis®（0.05%环孢素A乳剂）滴眼治疗，每日两次，持续7天。 3. 疗效评估指标： * 临床指标： 在治疗第0、1、3、5、7天进行评估。包括：角膜荧光素染色（评分0-4分，评估上皮缺损）、Schirmer试验（测量泪液分泌量）、泪膜破裂时间。 * 组织学分析： 治疗结束后，取小鼠眼球进行组织切片和染色。包括：苏木精-伊红染色（评估角膜上皮厚度、泪腺结构）、过碘酸希夫染色（评估结膜杯状细胞数量）。 * 免疫组化/免疫荧光： 检测角膜组织中ROS、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、TUNEL（细胞凋亡）和IL-6的表达水平。通过角膜全片免疫荧光染色，评估巨噬细胞表型（CD86+/CD206+比例）。
第四阶段：生物安全性评估 1. 体外细胞毒性： 使用CCK-8法和活/死细胞染色评估NPs对HCECs和RAW264.7细胞的毒性。 2. 溶血实验： 评估NPs的血液相容性。 3. 短期眼表刺激性： 对健康小鼠滴眼后，使用前段光学相干断层扫描观察角膜厚度和完整性变化，并通过H&E染色验证。 4. 长期生物相容性： * 小鼠： 连续4周每周滴眼S-RHC NPs，监测体重变化，并通过前段OCT监测角膜厚度。治疗结束后，取主要器官（心、肝、脾、肺、肾）进行H&E染色，评估全身毒性。 * 家兔： 对新西兰白兔滴眼S-RHC NPs，在第0、7、14、21、28天进行裂隙灯检查，观察结膜充血、角膜损伤、前房混浊等异常情况。
四、 主要研究结果
1. 纳米颗粒成功构建并具备优异理化特性： 成功合成了单分散的RHC NPs，并通过巯基修饰得到S-RHC NPs。透射电镜显示其为均匀球形。S-RHC NPs的Zeta电位因巯基修饰从-49.4 mV升至-29.6 mV。与黏蛋白的结合实验表明，巯基修饰显著增强了NPs的黏液黏附能力，其中S2-RHC（巯基含量4.7%）结合力最强，推测中等密度的巯基最有利于与黏蛋白中富含半胱氨酸的区域形成二硫键，而过高的巯基可能导致NPs自身聚集。纳米颗粒追踪分析证实，S-RHC NPs在黏蛋白溶液中的运动轨迹受限，扩散系数显著低于未修饰的RHC NPs。体内荧光成像和角膜冰冻切片实验均证明，S-RHC NPs在眼表的滞留时间显著长于游离荧光素和未修饰的RHC NPs。XPS分析证实Ce以+3和+4混合价态存在。抗氧化实验表明，S-RHC NPs具有浓度依赖性的ABTS自由基清除能力，并能有效清除羟基自由基。其总抗氧化活性主要来自多酚，铈离子也有部分贡献。有趣的是，在过氧化氢刺激下，S-RHC NPs表面出现更小的球状物分布，形态发生改变，这源于Ce³⁺向Ce⁴⁺的转变，可能增大了比表面积，进一步增强了抗氧化能力。
2. S-RHC NPs有效穿透黏液层并被细胞摄取，发挥强大的细胞保护作用： Transwell模型表明，S-RHC NPs与黏蛋白形成的二硫键连接是强健但可逆的，初期会阻碍内吞，但随后内吞作用逐渐恢复，最终达到与未修饰组相似的水平。机制研究表明，NPs主要通过巨胞饮和小窝蛋白介导的内吞途径进入细胞。在过氧化氢刺激的HCECs中，S-RHC NPs能有效清除细胞内ROS，减轻脂质过氧化（降低MDA水平），恢复SOD活性，并显著减少细胞凋亡。RNA-seq和蛋白质组学分析揭示，S-RHC NPs能下调与细胞应激、凋亡（如PPP1R15A， JUN， GADD45A）、p53信号通路和IL-17信号通路相关的基因，同时上调抗凋亡Bcl-2家族基因，下调热休克蛋白。此外，NPs还能显著减少由氧化应激诱导的DNA双链断裂标志物γ-H2A.X的焦点形成，显示出对细胞核的保护作用。
3. S-RHC NPs能有效诱导巨噬细胞从促炎M1表型向抗炎M2表型复极化： 在LPS刺激的RAW264.7细胞中，S-RHC NPs能被巨噬细胞有效内吞（主要通过网格蛋白介导的内吞和巨胞饮）。NPs处理使巨噬细胞形态从多伪足的不规则形转变为纺锤形，流式细胞术显示M2/M1表型细胞比例显著升高，且效果优于单独的迷迭香酸或铈离子，显示出协同作用。ELISA检测显示，NPs处理增加了抗炎因子TGF-β的分泌，同时将促炎因子TNF-α和IL-6的水平降低至正常。免疫荧光显示iNOS表达下降而Arg1表达上升，Griess法检测到NO生成减少。这些结果共同证实了S-RHC NPs强大的抗炎和免疫调节能力。
4. S-RHC NPs在两种干眼症小鼠模型中均展现出卓越的治疗效果： 在BAK诱导的蒸发过强型干眼模型中，S-RHC NPs治疗组在角膜荧光素染色评分、Schirmer试验（泪液分泌量）和泪膜破裂时间这三个关键临床指标上均表现出最快、最显著的改善，其疗效在治疗第3天即优于临床阳性药Restasis®。组织学显示，S-RHC NPs能有效恢复角膜上皮厚度、增加结膜杯状细胞数量，并改善泪腺病理结构。免疫组化显示，S-RHC NPs能显著降低角膜中ROS、MMP-9、TUNEL阳性细胞和IL-6的水平。角膜全片免疫荧光证实，S-RHC NPs能有效促进巨噬细胞向M2表型极化。 在东莨菪碱诱导的水液缺乏型干眼模型中，S-RHC NPs同样表现出最优的治疗效果，能快速修复角膜上皮缺损、增加泪液分泌、恢复泪膜稳定性，并在组织学和免疫组化层面显示出强大的抗氧化、抗凋亡和抗炎作用，其疗效不劣于Restasis®。
5. S-RHC NPs具有良好的生物相容性： 体外细胞毒性实验表明，即使在较高浓度下，NPs对两种细胞系的存活率均高于85%。溶血率极低。短期和长期的眼部及全身毒性评估显示，滴眼后角膜结构完整，厚度无显著变化，主要器官无病理学改变，家兔眼表无刺激性反应，小鼠体重正常增长。这些结果证明了S-RHC NPs优异的生物安全性。
五、 研究结论与价值
本研究成功开发了一种基于迷迭香酸自聚合、并与透明质酸和铈离子共组装、最后进行硫醇化修饰的新型纳米眼用制剂平台（S-RHC NPs）。该平台巧妙地将天然多酚的强抗氧化/抗炎特性、铈离子的纳米酶活性以及硫醇基团增强的黏液黏附能力整合于一体。
科学价值： 1. 方法学创新： 提供了一种简便通用的“自聚合-共组装-功能化”策略，用于构建基于天然多酚的多功能纳米颗粒，为利用其他天然酚类化合物开发纳米药物提供了新思路。 2. 机制深入阐释： 系统揭示了S-RHC NPs通过可逆的黏液黏附实现长效滞留，通过协同的ROS清除和抗炎作用（包括调控p53、IL-17等关键信号通路，诱导巨噬细胞M1向M2复极化），以及促进角膜上皮修复和杯状细胞再生，多靶点、多机制地打破干眼症的氧化应激-炎症恶性循环。 3. 模型验证全面： 在两种不同病理机制的干眼症动物模型中均验证了其疗效，证明了该平台的普适性和有效性。
应用价值： 1. 治疗前景： S-RHC NPs作为一种集成的纳米眼用制剂，在缓解干眼症症状（角膜上皮缺损、泪液分泌不足、泪膜不稳定）方面显示出优于现有临床药物（Restasis®）的潜力，且起效更快。 2. 平台潜力： 该策略不仅限于干眼症治疗，其核心设计理念（长效黏附、抗氧化、抗炎）可扩展到其他与氧化应激和慢性炎症相关的眼部或全身性疾病的治疗中。 3. 转化可行性： 研究证明了该纳米制剂良好的生物相容性和安全性，为其未来的临床转化奠定了基础。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
本研究在实验设计和数据分析上体现了高度的严谨性。例如，在评估黏液黏附时，不仅进行了体外结合实验和轨迹分析，还设计了在体（麻醉小鼠）和离体（非麻醉小鼠角膜切片）两种荧光滞留实验，相互印证。在评估巨噬细胞复极化时，综合运用了形态学观察、流式表型分析、细胞因子检测和关键酶标志物染色等多种方法，结论全面可靠。此外，研究将商业化的环孢素A乳剂（Restasis®）作为阳性对照，直接对比了疗效，增强了其临床相关性。长期安全性评估涵盖了小鼠和家兔两种动物，并采用了OCT、裂隙灯、组织病理学等多种手段，系统性评估了局部和全身毒性，为后续开发提供了重要的安全性数据支持。