这是一篇原创性研究论文，属于类型a。
巨噬细胞Sprouty4缺失减轻小鼠脓毒症诱导的急性肺损伤研究报告
一、研究概况
本研究报告了由武汉大学人民医院麻醉科的孟庆涛教授课题组主导完成的一项原创性科研成果。该论文第一作者为Rong Chen、Chen Cao和Huimin Liu，于2022年10月22日在线发表在国际知名学术期刊《Redox Biology》上。研究聚焦于脓毒症诱导的急性肺损伤（acute lung injury, ALI）这一危重病领域的核心难题，首次揭示了巨噬细胞中Sprouty4（Spry4）蛋白的调控作用及其分子机制，为脓毒症急性肺损伤的预测和治疗提供了新的潜在靶点。
二、研究背景与目的
脓毒症是重症监护病房中患者死亡的主要原因之一，常引发多器官功能障碍，而肺脏是最易受损的器官之一。一旦脓毒症患者并发急性肺损伤，其死亡率和不良预后风险会显著升高。现有治疗手段虽不断进步，但效果仍不理想。目前学界公认，过度的炎症反应和氧化应激在脓毒症急性肺损伤的发病机制中扮演着关键角色。因此，抑制炎症因子和活性氧的过度产生是改善肺功能和生存状况的重要策略。
AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）是细胞内能量稳态的核心调节器，近年来大量研究表明，AMPK的功能远不止于此，它还深度参与调控炎症和氧化应激过程。例如，激活AMPK可以抑制核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）和NOD样受体蛋白3炎症小体的活化，从而减轻炎症反应；同时，激活AMPK还能上调核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）的表达，增强机体的抗氧化能力。因此，AMPK通路被认为是治疗脓毒症急性肺损伤的一个极具前景的干预靶点。
Sprouty（Spry）蛋白家族是受体酪氨酸激酶信号通路的负调控因子，其中Spry4蛋白对肺的形态发生至关重要。小鼠若缺失Spry4会导致胚胎死亡并伴有严重的肺部形态发育缺陷。已有研究发现，在脊髓损伤等病理应激下，Spry4也会参与炎症和组织损伤的调节。例如，脊髓损伤后，Spry4敲除小鼠的炎症反应减轻，神经功能显著恢复。然而，Spry4在脓毒症诱导的急性肺损伤中的具体作用及分子机制，在开展此项研究前尚不明确。因此，本研究的核心目的即是探究巨噬细胞Spry4在脓毒症相关急性肺损伤中的角色及其潜在的下游机制。
三、详细研究流程与方法
为达成研究目标，课题组设计了一系列严密的体内和体外实验。
首先，为了初步观察Spry4与疾病的关系，研究者整合了来自GEO数据库的三组小鼠盲肠结扎穿刺（Cecum Ligation and Puncture, CLP）诱导脓毒症肺损伤模型的基因表达谱数据。通过生物信息学分析，筛选出交集的关键差异表达基因。同时，建立CLP小鼠模型，检测其肺组织和肺泡巨噬细胞中Spry4蛋白的表达水平，并分析巨噬细胞Spry4表达与肺损伤指标（乳酸脱氢酶活性）的相关性。在体外，研究者分离培养了小鼠骨髓源性巨噬细胞和人单核细胞源性巨噬细胞，并使用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激以模拟脓毒症环境，检测Spry4的mRNA表达变化。此外，为将研究向临床转化，团队还收集了脓毒症患者的外周血单个核细胞，对比分析有无急性肺损伤并发症的患者及健康对照者中Spry4的表达差异，并评估其对肺气体交换功能的预测价值。
其次，为深入阐明巨噬细胞Spry4的功能，研究者利用Cre-loxP系统构建了多种基因工程小鼠模型。第一，通过将Spry4-floxed小鼠与Lyz2-Cre小鼠杂交，获得了髓系特异性Spry4敲除小鼠（spry4mko），实现在巨噬细胞中特异性敲除Spry4。第二，利用piggyBac转座子系统，在CD68启动子驱动下，建立了巨噬细胞特异性Spry4过表达转基因小鼠（spry4mtg）。这两种小鼠及其各自的同窝对照鼠均被用于CLP手术以诱导细菌性脓毒症急性肺损伤。手术24小时后，对小鼠进行多维度评估，包括：通过苏木精-伊红染色进行肺组织病理学检查和炎症评分；测量肺湿干比以评估肺水肿程度；检测支气管肺泡灌洗液中总蛋白含量以判断肺泡-毛细血管屏障通透性；使用肺功能检测系统分析气道阻力、肺顺应性和肺通气量；采集动脉血进行血气分析（氧分压、二氧化碳分压等）评估气体交换功能；并记录手术后的生存率。此外，为验证巨噬细胞Spry4的核心作用并排除其他细胞类型的影响，研究者实施了骨髓移植实验，将spry4mko小鼠的骨髓细胞移植到经致死剂量辐照的野生型小鼠体内，重建其免疫系统后再进行CLP造模，观察肺损伤表型。还通过注射Ly6G抗体耗竭中性粒细胞，进一步确认观察到的表型是由巨噬细胞而非中性粒细胞主导。
第三，为了验证Spry4对炎症和氧化应激的具体影响，课题组在上述动物模型上进行了一系列分子生物学检测。包括：用酶联免疫吸附试验检测支气管肺泡灌洗液中的炎症因子白细胞介素-1β和白细胞介素-6的水平；计数总细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，并检测髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）活性以评估中性粒细胞浸润情况；检测核蛋白中NF-κB的转录活性。为评估氧化应激水平，研究者使用2‘,7’-二氯荧光素二乙酸酯荧光探针检测总活性氧水平，并分别定量检测了过氧化氢和超氧阴离子的产生。此外，还检测了脂质过氧化产物丙二醛和4-羟基壬烯醛、蛋白质氧化产物蛋白羰基以及总抗氧化能力和总超氧化物歧化酶活力，以全面评价氧化损伤和抗氧化防御能力。同时，通过Western blot检测了关键的抗氧化转录因子Nrf2的蛋白表达水平。这些实验同步在体外LPS刺激的spry4mko和spry4mtg小鼠来源的骨髓源性巨噬细胞上进行了验证。
第四，为揭示其分子机制，研究者对CLP手术后spry4fl/fl与spry4mko小鼠的肺组织进行了转录组测序及生物信息学分析，寻找关键的差异表达通路。分析强烈提示AMPK信号通路参与其中。研究者继续通过Western blot检测了CLP小鼠及转基因小鼠肺组织中AMPK的磷酸化水平，证实Spry4对AMPK通路的负向调控关系。为确证AMPK是Spry4发挥功能所必需的，研究者将spry4mko小鼠与全身性AMPKα2敲除小鼠（ako）杂交，构建了Spry4和AMPK的双基因敲除小鼠。同时，还在体内外实验中使用了AMPK的药理学抑制剂Compound C。通过观察在这些干预下，Spry4缺失带来的保护效应是否能被抵消，来最终确立AMPK在其中的关键地位。最后，研究者深入探究了Spry4缺失激活AMPK的上游机制，通过检测钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶2（calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2, CaMKK2）的磷酸化水平，并在细胞实验中使用其特异性抑制剂STO-609，验证了CaMKK2是连接Spry4缺失与AMPK激活的中间环节。
四、主要研究结果阐述
研究结果清晰地展示了巨噬细胞Spry4在脓毒症急性肺损伤中的致病角色。
初步探索阶段的数据显示，通过生物信息学分析，Spry4在三组脓毒症小鼠肺组织数据集中表达均一致性上调。与此一致，CLP模型小鼠的肺组织和肺泡巨噬细胞中Spry4蛋白水平也显著增加，且其表达量与肺损伤标志物乳酸脱氢酶活性呈正相关。体外实验证实，LPS刺激可直接诱导小鼠和人的巨噬细胞上调Spry4的mRNA。更关键的是，脓毒症患者外周血单个核细胞中的Spry4 mRNA水平不仅高于健康对照，而且在合并急性肺损伤的患者中更高。当以中位数将患者分为高、低Spry4表达组时，高表达组患者的动脉血氧分压（partial pressure of oxygen, PaO2）显著降低，而二氧化碳分压（partial pressure of carbon dioxide, PaCO2）显著升高，提示其肺功能更差。这些结果共同表明，巨噬细胞Spry4在脓毒症肺损伤中被诱导升高，且与疾病严重程度正相关。
基因功能验证的结果进一步确立了Spry4的致病作用。与对照组相比，巨噬细胞特异性敲除Spry4的小鼠在经历CLP手术后，表现出显著减轻的肺损伤，具体体现为肺部病理损伤减轻、炎症评分降低、乳酸脱氢酶释放减少、肺水肿（肺湿干比）和肺泡通透性（支气管肺泡灌洗液总蛋白）明显改善。肺部功能测定和血气分析也显示，敲除小鼠的气道阻力增加、肺顺应性和肺通气的降低以及气体交换障碍（PaO2下降和PaCO2上升）均得到显著缓解。最终，spry4mko小鼠的生存率显著高于对照组。与之形成鲜明对比的是，巨噬细胞特异性Spry4过表达小鼠在CLP手术后，上述所有肺损伤指标、功能障碍和死亡率均表现为显著恶化。骨髓移植实验证实，仅替换骨髓源性巨噬细胞就足以将Spry4缺失的保护性表型传递给野生型小鼠；而中性粒细胞耗竭实验则排除了中性粒细胞在此过程中的主要贡献。这确认了是巨噬细胞内在的Spry4直接调控了脓毒症相关急性肺损伤的发生发展。
在机制探究层面，研究者发现Spry4缺失对炎症和氧化应激具有强大的抑制作用。在CLP模型中，spry4mko小鼠的支气管肺泡灌洗液中炎症因子水平、炎性细胞总数及中性粒细胞浸润（MPO活性）均显著降低，且关键的促炎转录因子NF-κB的活性受到抑制。在氧化应激方面，spry4mko小鼠肺内的活性氧、过氧化氢和超氧阴离子水平均较低，脂质和蛋白质的氧化损伤产物也相应减少。这表明Spry4缺失有效打破了脓毒症导致的过度炎症和氧化损伤状态。机制上，研究发现Spry4缺失的肺组织中抗氧化核心转录因子Nrf2的蛋白表达得以恢复，总抗氧化能力和超氧化物歧化酶活性也随之反弹，这解释了氧化损伤减轻的原因。后续的转录组测序和分析将AMPK通路锁定为表型改变的首要贡献者。实验验证证实，Spry4缺失小鼠的肺组织中AMPK磷酸化水平显著升高，而Spry4过表达则抑制其磷酸化。当通过基因双敲除或使用Compound C药物在体内、体外阻断AMPK活性后，Spry4缺失所带来的抗炎、抗氧化以及肺保护效应均被大幅度消除，有力证明了Spry4的保护作用正是通过激活AMPK通路实现的。最终，研究证实Spry4缺失后，其上游激酶CaMKK2的磷酸化水平升高，而使用STO-609抑制CaMKK2则可阻断AMPK的激活及下游的保护效应，从而确定了“巨噬细胞Spry4缺失—CaMKK2激活—AMPK激活—抑制炎症和氧化应激—减轻急性肺损伤”这一完整的保护性信号通路。
五、研究结论与价值
本研究首次阐明，巨噬细胞中的Spry4是脓毒症诱导的急性肺损伤中的一个正向调控分子。其核心结论是：巨噬细胞Spry4缺失通过激活CaMKK2/AMPK通路，有效减轻了脓毒症相关的肺部炎症、氧化应激和损伤。反之，Spry4过表达则加剧了病情。
该研究具有重要的科学价值和应用前景。在科学上，它更新了对Spry4蛋白功能的认知，将其从传统的发育调控因子和受体酪氨酸激酶信号抑制剂扩展到了炎症和氧化应激调控领域，并首次建立了Spry4与AMPK这个关键代谢-炎症调控枢纽的直接功能联系。在临床应用上，研究提示，检测外周血单个核细胞中的Spry4表达水平可作为预测脓毒症患者发生急性肺损伤风险及病情严重程度的生物标志物，并且，靶向抑制巨噬细胞中的Spry4或激活其下游的AMPK通路，可能成为治疗脓毒症急性肺损伤的一种新型治疗策略，为改善这类高危患者的预后提供了新的干预靶点。
六、研究亮点
本研究的亮点在于：第一，发现了巨噬细胞Spry4作为脓毒症急性肺损伤中的新调控因子，揭示了其在炎症和氧化应激中的全新功能；第二，实验设计严谨且全面，通过巨噬细胞特异性基因敲除和过表达小鼠模型，并结合骨髓移植、中性粒细胞耗竭、双基因敲除等多种技术手段，从正反两面层层递进地、明确地证明了巨噬细胞Spry4的致病作用，逻辑链条清晰完整；第三，机制的阐释深入且新颖，不仅发现了AMPK是其关键下游效应通路，还进一步鉴定了上游激酶CaMKK2，首次构建了“Spry4-CaMKK2-AMPK”这一调控脓毒症急性肺损伤的信号轴，为深入理解该疾病的发病机制和开发靶向药物提供了新的理论依据和分子蓝图。