人类多能干细胞衍生的中脑类器官包含功能性多巴胺能神经元和神经黑色素生成神经元的研究报告

第一作者及研究机构
本研究的通讯作者为Huck Hui Ng（新加坡基因组研究所）和Hyunsoo Shawn Je（杜克-新加坡国立大学医学院）。合作机构包括新加坡基因组研究所、杜克-新加坡国立大学医学院、约翰霍普金斯大学医学院等。研究发表于2016年8月的Cell Stem Cell期刊（DOI:10.1016/j.stem.2016.07.005）。

学术背景
研究领域为干细胞与神经发育，重点关注三维（3D）类器官模型在模拟人类中脑发育及疾病中的应用。传统二维（2D）培养系统难以复现中脑多巴胺能神经元（mDA神经元）的复杂功能，尤其是神经黑色素（neuromelanin, NM）的生成——这一特性与帕金森病（PD）的病理密切相关。本研究的目标是建立一种中脑类器官（hMLOs）模型，以生成具有功能性mDA神经元和NM的3D结构，为研究人类中脑发育和PD提供新工具。

研究流程
1. 类器官生成与分化
- 起始阶段：将人类胚胎干细胞（hESCs）解离为单细胞，形成直径约400 μm的拟胚体（EBs），并在低吸附培养皿中培养。
- 神经诱导：通过双重SMAD抑制因子（Noggin和SB431542）和Wnt通路激活剂（CHIR99021）促进神经外胚层分化，随后添加中脑模式化因子SHH和FGF8，定向分化为中脑底板前体细胞。
- 3D培养：将神经球包埋于基质胶（Matrigel）中，置于轨道摇床中培养，添加神经营养因子（BDNF、GDNF等），最终形成直径超过2 mm的类器官。

1. 细胞表征与验证

   • 免疫组化与流式分析：检测中脑标志物（FOXA2、OTX2、LMX1A）和多巴胺能神经元标记物（TH、DAT）。结果显示，45天时54%的FOXA2+细胞共表达TH，60天时22%的MAP2+神经元为TH+。
     
   • 转录组分析：通过RNA测序比较hMLOs与2D培养的mDA神经元，发现hMLOs更接近人类胎儿中脑的基因表达谱，例如胶质细胞基因SLC1A3和少突胶质细胞基因OLIG3的特异性上调。
     

2. 神经黑色素（NM）的鉴定

   • 形态学观察：培养60天后，hMLOs中出现黑色颗粒，经Fontana-Masson染色确认与人类尸检中脑组织的NM结构相似。
     
   • 功能验证：外源添加L-DOPA或DA可加速NM生成，而小鼠ESC衍生的类器官（mMLOs）无此现象，表明NM生成具有人类特异性。
     

3. 电生理功能验证

   • 膜片钳记录：hMLOs中的神经元表现出电压依赖性钠/钾电流、自发性突触后电流（sEPSCs/sIPSCs）及节律性放电（平均频率2.78 Hz），证实其功能成熟。
     
   • 多巴胺检测：HPLC显示hMLOs的DA含量随培养时间增加，进一步支持其功能性。
     

主要结果
1. 中脑类器官的层状结构：类器官再现了中脑的腹侧区（VZ）、中间区（IZ）和套层（MZ），其中VZ包含增殖性前体细胞（OTX2+），MZ富含成熟mDA神经元（TH+）。
2. NM的生成：hMLOs是首个在体外生成NM的模型，其NM颗粒的形态和生化特性与人类中脑NM一致，为研究PD中NM的毒性或保护作用提供了新平台。
3. 转录组特异性：hMLOs的基因表达谱更接近胎儿中脑，而非2D培养的神经元，提示3D环境对细胞成熟的促进作用。

结论与意义
本研究首次建立了包含功能性mDA神经元和NM的人类中脑类器官模型，其科学价值在于：
1. 疾病建模：为研究PD中NM的病理机制（如氧化应激或免疫激活）提供了可控的体外系统。
2. 发育生物学：揭示了3D环境对中脑细胞分化和成熟的调控作用。
3. 转化应用：未来可通过患者来源的iPSCs构建疾病特异性类器官，用于药物筛选或个性化治疗。

研究亮点
1. 创新模型：首次在3D类器官中实现NM生成，填补了PD研究的技术空白。
2. 跨学科方法：结合单细胞转录组、电生理和超微结构分析（SEM/AFM），全面验证类器官的生物学特性。
3. 人类特异性：NM生成仅见于人类细胞，突出了模型在转化医学中的优势。

其他价值
研究还发现hMLOs中存在A9亚型mDA神经元（表达GIRK2），这类神经元在PD中选择性退化，进一步增强了模型的病理相关性。此外，类器官中神经元网络的自发性电活动为研究神经环路功能障碍提供了新思路。