关于单克隆抗体在长期冷冻储存中稳定性的研究报告：聚焦冷冻浓缩效应对抗体聚集与氧化的影响

本研究由来自德国慕尼黑路德维希-马克西米利安大学药学院的Oliver Bluemel与Wolfgang Friess*（通讯作者）以及来自瑞士诺华制药技术研发部的Jakob W. Buecheler与Karoline Bechtold-Peters，以及奥地利山德士公司的Astrid Hauptmann与Georg Hoelzl共同合作完成。研究成果以《The effect of mab and excipient cryoconcentration on long-term frozen storage stability – Part 2: Aggregate formation and oxidation》为题，于2021年12月25日在线发表于期刊 International Journal of Pharmaceutics: X 2022年第4卷。

一、 研究背景与目的

本研究的科学领域属于生物制药学，具体聚焦于治疗性蛋白质，特别是单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）的制剂与稳定性。单克隆抗体是高价值的生物技术产品，但其在生产、储存和运输过程中面临着诸多挑战，例如物理化学降解。冷冻储存常用于分离药物物质与制剂生产过程，以增强稳定性并提供制造灵活性。然而，冷冻过程本身也伴随着风险，其中冷冻浓缩（cryoconcentration） 是一个关键问题。由于大分子蛋白质与小分子赋形剂的扩散系数不同，在大型容器（如2升瓶）中冷冻时，它们会以不同的速率和程度被排除在生长的冰晶之外，导致容器内不同区域形成不均匀的冷冻浓缩基质（freeze-concentrated matrix, FCM），并且蛋白质与稳定剂的比例会发生空间上的偏移。这种浓度和成分的异质性对长期冷冻储存稳定性的影响尚不完全清楚。

先前的研究（作者团队在2020年的工作）已经证实了大规模冷冻过程中显著的浓度变化以及mAb与组氨酸缓冲液比例的空间差异。然而，这些浓度偏移对蛋白质长期冷冻储存稳定性的具体影响，尤其是对聚集和氧化等关键降解途径的影响，仍需深入探究。因此，本研究旨在系统性地模拟大型容器中因冷冻浓缩导致的浓度变化，评估mAb自身浓度和缓冲液浓度如何影响其在六个月长期冷冻储存（-10°C）中的稳定性，重点关注高分子量物质（higher molecular weight species, HMWS）、亚可见颗粒（subvisible particle, SVP）、浊度（OD350）以及mAb氧化（oxidation） 水平的变化。研究目标是为优化大规模冷冻储存工艺和制剂处方提供直接的实验依据。

二、 研究详细工作流程

本研究是一项系统性、控制变量的实验研究，主要包含样品制备、稳定性储存和分析测试三个核心部分。

1. 样品设计与制备：

   • 研究对象与设计：研究选择了两种人源化IgG1单克隆抗体（mAb1和mAb2）。mAb1配制在组氨酸/己二酸缓冲液（pH 5.5）中，mAb2配制在己二酸缓冲液（pH 5.2）中。为了模拟冷冻浓缩可能导致的浓度变化，研究为每种mAb设计了两组样品系列：
     • 第一组（固定mAb浓度）：保持mAb浓度恒定为5 mg/mL，但变化缓冲液浓度。对于mAb1，缓冲液浓度梯度为：零、低、中、高、最大组氨酸浓度；对于mAb2，缓冲液浓度梯度类似（零、低、中、高、最大己二酸浓度）。无缓冲液样品通过透析到高纯水（Highly Purified Water, HPW）中制备。
     • 第二组（固定缓冲液浓度）：使用中等浓度的缓冲液（中组氨酸或中己二酸），变化mAb浓度，梯度为：0、2.5、5、7.5、10 mg/mL。 所有样品的配制均基于原始储备液进行稀释或透析，并确保最终pH符合要求。
   • 样品处理与储存：将所有样品灌装至2R玻璃小瓶中（每瓶1 mL），并使用半加塞的氟树脂（Flurotec®）冻干塞密封。所有样品在冻干机中进行可控冷冻：以1 K/min降温至-5°C，保持60分钟以诱导受控成核，然后以1 K/min继续降温至-40°C。冷冻完成后，所有样品立即转移至预冷至-10°C的冰箱中，置于聚苯乙烯保温盒内以减少温度波动，进行为期6个月的长期储存。研究设置了起始时间点（T0）样品，同样经过冷冻并在-10°C储存12小时后进行分析。

2. 稳定性分析与表征：

   • 储存6个月后，对样品进行解冻并采用一系列分析技术进行表征，所有分析均设置复样。
   • 尺寸排阻色谱（Size-Exclusion Chromatography, SEC）：使用Agilent 1200 HPLC系统配备TSKgel G3000 SWXL色谱柱，以150 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.5）为流动相，在210 nm波长下检测。用于定量分析可溶性高分子量物质（HMWS，即聚集体）的含量。
   • 流动成像显微镜（Flow Imaging Microscopy）：使用FlowCAM® 8100系统分析亚可见颗粒（SVP ≥ 1 μm）的数量和大小分布。
   • 紫外/可见分光光度法（OD350）：使用微孔板读数仪在350 nm波长下测量样品的光密度，以评估可能导致浊度变化的较大聚集体的形成。
   • Protein A分析色谱：采用基于Loew等人方法的Protein A色谱（HPLC）来评估mAb的氧化水平。该方法可以分离和定量Fc区域发生不同程度甲硫氨酸氧化的抗体组分。
   • 动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）与相互作用参数Kd：使用DynaPro Plate Reader III测量mAb在不同缓冲液浓度下的扩散系数。通过绘制扩散系数随蛋白质浓度的变化并进行线性拟合，可以计算出相互作用参数（interaction parameter, Kd）。Kd值反映了蛋白质-蛋白质间的净相互作用力：正值表示净排斥作用，负值表示净吸引作用。这是评估制剂胶体稳定性的一个重要生物物理指标。 本研究中未涉及特殊的自发明设备或算法，而是综合运用了生物制药稳定性研究中成熟且标准化的分析技术。

三、 主要研究结果

1. 可溶性聚集体（HMWS）的形成：

   • mAb浓度的影响：对于mAb1和mAb2，在固定缓冲液浓度下改变mAb浓度（2.5至10 mg/mL），经过6个月储存后，HMWS水平仅有微小幅度的增加（约0.2%），且与mAb浓度变化无关。这表明，在所研究的浓度范围内，mAb浓度的变化本身并未显著驱动可溶性聚集体的形成。
   • 缓冲液浓度的影响：对于mAb1（组氨酸缓冲液），随着组氨酸浓度的增加，储存后的HMWS水平显著上升，从“低”浓度组的1.9%升至“最大”浓度组的6.4%。无缓冲液（HPW）的mAb1样品显示出最高的HMWS水平（7.6%），但其pH（5.9）略高于缓冲样品（pH 5.5），这可能是一个混杂因素。 对于mAb2（己二酸缓冲液），除了无缓冲液样品（HMWS为6.4%，pH 5.7）外，其他不同己二酸浓度样品的HMWS水平均保持在较低水平（约0.3%），且无明显变化趋势。
   • 结果逻辑关联：这些结果表明，缓冲液组分（特别是组氨酸）及其浓度对可溶性聚集体的形成有显著影响，而蛋白质浓度本身的影响较小。这引出了对蛋白质-蛋白质相互作用的研究需求。

2. 亚可见颗粒（SVP）的形成：

   • mAb浓度的影响：在储存6个月后，两种mAb的SVP数量均随mAb浓度的增加而显著上升。例如，mAb2浓度从2.5 mg/mL增加到10 mg/mL时，SVP数量从约52,300个/瓶激增至约166,700个/瓶。
   • 缓冲液浓度的影响：缓冲液浓度的升高同样加剧了SVP的形成。mAb1在“最大”组氨酸浓度下SVP计数达到约166,100个，而mAb2在“最大”己二酸浓度下达到约95,200个。
   • 无缓冲液样品：值得注意的是，无缓冲液的mAb1和mAb2样品在储存后SVP数量均保持在较低水平（分别约13,800和24,300个），与其在HMWS上的高表现形成鲜明对比。
   • 结果逻辑关联：SVP的结果与HMWS的结果模式不同，表明聚集的路径可能不同。高mAb浓度和高离子强度（来自缓冲盐）的环境更易诱发形成较大的、不溶性颗粒。这也促使研究者进一步探究其背后的分子间相互作用。

3. 光学密度（OD350）：

   • 结果显示，无论是改变mAb浓度还是缓冲液浓度，经过6个月储存后，样品在350 nm处的光密度均未显示出清晰、一致的变化趋势。许多样品甚至没有可检测到的变化。这表明，在本研究条件下，可能未形成足够多或足够大的、能引起显著光散射（浊度）的聚集体。这也印证了聚集分析需要多维度手段（SEC, FIM, OD）的必要性。

4. 单克隆抗体氧化：

   • mAb浓度的影响：对于两种mAb，储存后的氧化水平均表现出与mAb浓度负相关的趋势。即mAb浓度越低，氧化程度越高。例如，2.5 mg/mL的mAb1样品氧化水平为7.7%，而10 mg/mL的样品仅为5.0%。
   • 缓冲液浓度的影响：对于mAb1，组氨酸浓度的增加会加剧氧化（从无缓冲液样品的4.9%升至“最大”浓度组的7.4%）。对于mAb2，己二酸浓度的影响趋势不明确。
   • 结果逻辑关联：这是本研究的一个重要发现，首次在长期冷冻储存的背景下系统报告了mAb的氧化现象，并揭示了其与蛋白质浓度的负相关性以及缓冲液成分（组氨酸）的潜在促氧化作用。

5. 相互作用参数Kd：

   • 动态光散射结果显示，随着组氨酸（mAb1）或己二酸（mAb2）缓冲液浓度的增加（即离子强度增加），Kd值下降。mAb1的Kd从“低”组氨酸的24.6 mL/g降至“最大”组氨酸的1.8 mL/g。mAb2的Kd甚至变为负值（-4.2 mL/g，在“最大”己二酸下），表明净相互作用从排斥转向吸引。
   • 结果逻辑关联：Kd值的变化为理解上述聚集结果提供了物理解释。更高的离子强度屏蔽了蛋白质分子间的静电排斥力，导致净相互作用变得更吸引，从而增加了蛋白质聚集（尤其是SVP形成）的风险。无缓冲液样品由于数据非线性未进行Kd分析，但其低SVP计数可能源于较强的静电排斥作用。

四、 研究结论与价值

本研究系统揭示了在模拟大规模冷冻浓缩条件下，单克隆抗体和缓冲液浓度的微小变化对其长期冷冻储存稳定性的显著影响。主要结论如下：

1. mAb浓度：增加mAb浓度不会显著增加可溶性聚集体的形成，但会显著促进亚可见颗粒的产生。然而，更高的mAb浓度有助于降低氧化风险。
2. 缓冲液浓度：增加缓冲液浓度（从而增加离子强度）会减弱蛋白质分子间的排斥相互作用，从而促进亚可见颗粒的形成。对于特定的缓冲体系（如组氨酸），还可能增加可溶性聚集和氧化。
3. 无缓冲液环境：虽然无缓冲液条件下可溶性聚集体水平最高（可能与pH偏移有关），但其亚可见颗粒数量最低，且氧化水平也较低（对于mAb1）。这表明离子强度的缺失可能抑制了较大颗粒的聚集途径。
4. 空间异质性的实际影响：将本研究结果映射到之前观察到的2升瓶中冷冻浓缩的空间分布上，可以推断：
   • 容器顶部区域（mAb浓度最高处）是亚可见颗粒形成的高风险区，但氧化风险较低。
   • 容器中心底部区域（缓冲液相对浓度较高处）同样面临较高的亚可见颗粒风险，对于组氨酸缓冲液体系，还可能面临较高的可溶性聚集和氧化风险。
   • 容器壁附近区域（缓冲液浓度最低处）预期具有最高的总体稳定性。

本研究的科学价值在于，首次明确地将大规模冷冻过程中由扩散差异引起的空间浓度异质性与具体的蛋白质降解途径（聚集与氧化）在长期储存中的表现直接关联起来。其实践应用价值重大：它为生物制药行业优化大规模冷冻工艺和制剂处方提供了关键见解。 * 工艺优化：应采取措施减少冷冻浓缩效应，例如通过加快冷冻速率、或采用自底向上的定向冷冻来抑制自然对流。 * 处方优化：应避免使用不必要的过高缓冲液浓度，以防削弱蛋白质间的排斥力。同时，需要平衡降低mAb浓度以减少颗粒与增加mAb浓度以抑制氧化之间的关系。 * 质量控制：本研究强调了在长期冷冻储存稳定性研究中，除了常规的聚集分析外，监控蛋白质氧化也是一个不容忽视的重要参数。

五、 研究亮点

1. 创新性关联：研究创造性地将物理化学过程（冷冻浓缩导致的浓度梯度）与生物制药稳定性（聚集、氧化）在长期储存尺度上进行了直接、系统的关联。
2. 全面的降解途径分析：研究同时考察了可溶性聚集、亚可见颗粒、浊度和氧化四种关键的降解途径，提供了对mAb冷冻稳定性的多维、深入评估。
3. 对氧化降解的强调：明确揭示了长期冷冻储存中mAb氧化现象的存在及其对浓度因素的依赖性，特别是mAb浓度与氧化程度的负相关关系，这是一个容易被忽视但重要的发现。
4. 明确的实践指导意义：研究结论直接指向了改进大规模冷冻储存稳定性的具体工艺和处方策略，对工业化生产具有直接的指导价值。
5. 严谨的实验设计：通过设计两组独立的变量系列（固定mAb变缓冲液、固定缓冲液变mAb），清晰地区分和阐述了蛋白质与辅料各自浓度变化对稳定性的独立影响。

六、 其他有价值内容

研究还讨论了氧化可能的机制，引用了Authelin等人的观点，指出冷冻过程中溶解氧的浓缩过饱和以及可能形成的气泡界面，可能是引发氧化反应的主要场所。同时，研究也提及组氨酸本身可能存在的氧化及其催化金属杂质，可能是促进mAb1氧化的一个因素。这些讨论为理解观察到的氧化现象提供了更深层次的化学视角。