本研究由Yasheng Yan、Sarah Logan、Xiaojie Liu、Bixuan Chen、Congshan Jiang、Thiago Arzua、Ramani Ramchandran、Qing-song Liu及Xiaowen Bai等人完成，主要研究机构为威斯康星医学院（Medical College of Wisconsin）细胞生物学、神经生物学与解剖学系、药理学系、麻醉学系及儿科新生儿科。该研究成果于2022年8月11日发表于Cells期刊（2022, 11, 2497），论文标题为“Integrated Excitatory/Inhibitory Imbalance and Transcriptomic Analysis Reveals the Association between Dysregulated Synaptic Genes and Anesthetic-Induced Cognitive Dysfunction”。
全身麻醉药物对发育期大脑的潜在神经毒性是近年来麻醉学和神经科学领域关注的焦点问题。流行病学数据显示，美国每年约有2%的孕妇和超过130万5岁以下儿童接受涉及全身麻醉的外科手术。大量动物研究已证实，全身麻醉药可导致发育期神经毒性（anesthetic-induced developmental neurotoxicity, AIDN），表现为脑细胞死亡和神经元发育异常。人类前瞻性研究的荟萃分析亦表明，发育期全身麻醉暴露与长期的神经发育缺陷相关。
在神经发育的关键期——突触快速形成期，大脑对麻醉药物尤为敏感。每个神经元可接收成千上万的兴奋性和抑制性突触输入，大脑信息传递依赖于兴奋性与抑制性网络之间的功能平衡，即E/I平衡（excitatory/inhibitory balance）。在正常状态下，E/I比值保持稳定；而在麻醉状态下，抑制增强或兴奋减弱可导致E/I平衡的改变。在众多病理条件下，E/I失衡被视为多种神经发育障碍、神经退行性疾病及精神疾病的病因学重要因素。研究团队提出假设：麻醉药物可能通过诱导E/I失衡而导致认知功能障碍。
突触基因的异常表达与年龄相关及阿尔茨海默病相关的认知衰退密切相关，然而发育期麻醉暴露是否导致突触基因的长期改变尚不明确。异丙酚（propofol）通过激活GABAA受体降低神经元活性和兴奋性，既往研究已表明其可诱导与其他全身麻醉药相似的认知功能障碍。本研究旨在探索发育早期（出生后第7天）异丙酚暴露对成年期（出生后第60天）小鼠海马CA1锥体神经元E/I平衡的长期影响，并通过海马组织的转录组学分析和生物信息学深度挖掘，揭示麻醉诱导突触功能障碍和认知缺陷的分子机制。
研究选用C57BL/6小鼠，在出生后第7天（postnatal day 7, P7，相当于人类胚胎晚期）给予异丙酚暴露。幼鼠置于37°C温控孵育箱中，腹腔注射异丙酚（每次50 mg/kg体重）或10%脂肪乳剂作为对照。每次注射维持麻醉约90分钟，共注射2次或4次，以维持3小时或6小时的麻醉状态。该剂量基于前期研究确定为亚麻醉剂量，可诱导神经凋亡但不导致完全手术麻醉深度。实验包含雄性和雌性小鼠，随机分配至异丙酚组或对照组。部分小鼠在暴露后立即处死用于急性神经毒性检测，其余小鼠返回母笼饲养至P60用于慢性神经毒性研究。
对P7小鼠脑组织进行免疫荧光染色和蛋白质印迹（Western blot）分析。脑组织石蜡包埋后切为4μm矢状切片，采用兔抗切割半胱天冬酶3（cleaved caspase 3）抗体标记凋亡细胞，并与神经元核抗原（NeuN）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及S100共染色，以鉴定凋亡细胞的类型。采用Hoechst 33342标记细胞核。同时提取P7海马组织蛋白进行Western blot检测切割caspase 3和GFAP表达水平。
对P7暴露6小时异丙酚的P60小鼠进行Morris水迷宫测试。圆形水池（直径100 cm）充满不透明水，设四个象限，平台置于SE象限中央。第1-5天进行学习测试，每天4次试验（间隔5分钟），记录小鼠找到平台的潜伏期。第6天撤除平台，检测小鼠到达原平台区域的时间以评估记忆能力。使用EthoVision XT系统追踪小鼠运动轨迹。
对P7暴露6小时异丙酚的P60小鼠制备海马切片。小鼠断头后取海马，在蔗糖基溶液中用振动切片机切取400μm横向切片，转移至人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid, ACSF）中孵育。在全细胞电压钳记录模式下，记录海马CA1锥体神经元的微小兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic current, mEPSC）和微小抑制性突触后电流（miniature inhibitory postsynaptic current, mIPSC）。mEPSC记录时在ACSF中加入河豚毒素（TTX, 0.5 μM）阻断动作电位，加入GABAA受体阻断剂印防己毒素（picrotoxin, 50 μM）；mIPSC记录时加入TTX及谷氨酸受体拮抗剂CNQX（10 μM）和D-AP-5（20 μM）。同时进行场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potential, fEPSP）记录，通过刺激Schaffer侧支/连合通路绘制输入-输出曲线，并在不同脉冲间隔（20-400 ms）下记录配对脉冲比率（paired pulse ratio, PPR）。
对P7暴露3小时异丙酚的P60小鼠海马组织进行mRNA表达谱分析。海马组织在QIAzol试剂中裂解，以酚-氯仿法提取总RNA，使用DNA-free试剂盒去除基因组DNA污染。由Arraystar公司进行小鼠mRNA表达微阵列V3.0检测，分析24,881个mRNA的表达水平。以未配对t检验计算p值，Benjamini Hochberg法计算错误发现率（false-discovery rate, FDR），以标准化强度的绝对比值计算倍数变化（fold change）。差异表达mRNA筛选标准为倍数变化≥1.5且p<0.05。通过RT-qPCR对随机选取的两个差异表达基因进行验证。
通过SynGO数据库（https://www.syngoportal.org）筛选突触相关基因，利用Metascape平台进行GO富集分析，使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）工具分析差异表达基因参与的信号通路、网络及其与中枢神经系统发育、功能、行为及神经系统疾病的关联。
免疫荧光染色和Western blot结果显示，P7小鼠接受6小时异丙酚暴露后，海马组织中出现cleaved caspase 3阳性凋亡细胞，凋亡率从对照组的0.13%升至1.96%。共定位分析表明凋亡信号与NeuN阳性神经元重叠，而未见于GFAP和S100阳性的星形胶质细胞。此外，异丙酚暴露未改变GFAP蛋白表达水平，提示星形胶质细胞未被激活。这些数据表明异丙酚选择性诱导神经元凋亡，而不导致星形胶质细胞死亡或活化。
Morris水迷宫测试显示，P7接受6小时异丙酚暴露的P60小鼠在学习的第4天和第5天找到平台的潜伏期显著延长，表明学习能力受损；在第6天的记忆测试中，异丙酚组小鼠到达原平台区域的时间亦显著长于对照组，表明记忆能力受损。这证实了发育期麻醉暴露可导致长期的认知功能障碍。
mEPSC记录显示，异丙酚组mEPSC频率显著降低（t25=2.356, p=0.027），但平均振幅未受影响。累积频率分布分析显示，异丙酚组事件间隔累积曲线显著右移，而振幅累积分布无变化，提示突触前谷氨酸释放减少。fEPSP输入-输出曲线显示，异丙酚组在所有纤维群振幅大于0.2 mV的刺激强度下fEPSP斜率均显著降低。配对脉冲比率在20 ms、50 ms、200 ms和400 ms间隔时均显著升高，进一步支持突触前释放概率降低的结论。
mIPSC记录显示，异丙酚组mIPSC频率和事件间隔分布无显著变化，但平均振幅显著增加（t17=4.380, p<0.001），振幅累积曲线显著右移，提示抑制性突触传递增强是由突触后反应性增加介导的。兴奋性降低与抑制性增强的双重变化表明，发育期异丙酚暴露导致了持久的E/I失衡。
微阵列分析显示，与对照组相比，异丙酚组海马组织中共有317个mRNA差异表达（163个上调，154个下调）。RT-qPCR验证了微阵列数据的可靠性。IPA分析显示，这些差异表达基因涉及细胞稳态、神经元迁移、突触囊泡循环、海马损伤及多种神经系统疾病（如脑病、阿尔茨海默病、脑损伤）相关功能，其中8个基因参与Ephrin受体信号通路。
通过SynGO数据库注释，从317个差异表达基因中鉴定出23个突触基因（14个下调，9个上调），分别定位于突触前、突触后及突触膜等结构。GO富集分析揭示了这些基因在离子通道转运、p75 NTR受体介导信号、树突形态发生调控、化学突触传递调节及突触组织等方面的分子功能。
IPA分析进一步表明，这些突触基因与神经元发育（树突形成、神经发生、轴突延伸、树突棘生长）、突触形成与可塑性、以及多种行为和认知功能（如条件反射、工作记忆、学习、物体识别记忆、焦虑等）密切相关。网络分析预测了部分突触基因可能在调控网络中协同作用。
急性神经凋亡证实了异丙酚发育期暴露的神经毒性，认知行为学测试明确了长期认知缺陷的表型，电生理学揭示了E/I失衡的突触机制，而转录组学和生物信息学分析则从基因表达和信号通路水平为上述功能改变提供了分子基础——差异表达的突触基因直接参与突触传递、可塑性和认知功能的调控。
本研究的主要结论为：发育期异丙酚暴露通过降低突触前谷氨酸释放（兴奋减弱）和增强突触后GABA反应性（抑制增强）的双重机制，导致海马CA1锥体神经元的E/I失衡，从而引起长期的学习记忆障碍。23个差异表达突触基因的发现及其功能注释揭示了麻醉诱导慢性神经变性的潜在分子基础，提示E/I失衡和突触基因表达改变可能是异丙酚诱导认知功能障碍的重要机制。
本研究的科学价值在于：首次系统整合了电生理功能分析与转录组学分子分析，从突触功能表型和基因表达水平双重维度阐释了麻醉神经毒性的机制。其应用价值在于：通过对差异表达突触基因及信号网络的深入解析，为开发以恢复E/I平衡和调控突触基因为目标的治疗策略提供了潜在的分子靶点和理论依据。
多维度整合研究策略：本研究从急性神经病理、长期认知行为、突触电生理功能、全转录组表达谱到生物信息学网络分析，构成了完整的证据链，将表型观察深入至分子机制探索。
E/I平衡概念的创新应用：研究首次将E/I平衡这一主要在神经发育障碍和神经退行性疾病中讨论的概念系统引入麻醉发育期神经毒性研究，为该领域提供了新的理论视角。
突触基因的长期改变：首次在发育期麻醉暴露的成年动物海马中鉴定出持续至成年期的突触基因差异表达谱，为理解麻醉神经毒性的持久性提供了分子层面的解释。
突触前与突触后双位点机制阐明：通过电生理和基因表达双重数据，分别揭示了突触前谷氨酸释放减少和突触后GABA能反应增强的协同致病机制，为后续干预策略的精准设计提供了方向。