单细胞线粒体谱系追踪解析人造血类器官中的命运决定与空间克隆结构

主要作者与机构

该研究由香港大学李嘉诚医学院生物医学学院的薛燕（Yan Xue）、Joshua W. K. Ho和Ryohichi Sugimura担任通讯作者，联合香港大学、东南大学、海德堡大学医院及D²4H等多所机构的研究人员共同完成。论文发表于 Advanced Science 期刊，2026年第13卷，文章编号e18084，于2026年1月6日被接收。

学术背景

谱系追踪（lineage tracing）是理解胚胎发育、干细胞分化和疾病进展中细胞命运决定的核心技术手段。然而，现有的合成条形码（synthetic barcoding）系统——如LARRY（Lineage And RNA Recovery）——在精确性、多样性及细胞毒性方面存在固有局限，尤其在人胚胎多能干细胞（hPSCs）中，持续的CRISPR-Cas9活性可能诱发细胞毒性。另一方面，线粒体DNA（mtDNA）因其高突变率、异质性分离（heteroplasmic segregation）及与单细胞测序的兼容性，成为极具潜力的内源性谱系标记物。尽管已有MAESTER（线粒体变异富集）和mquad（变异识别算法）等工具，但线粒体变异作为谱系追踪标记在空间转录组背景下的应用尚未被充分探索。

该研究的核心目标是将线粒体体细胞突变作为内源性遗传条形码，结合单细胞与空间转录组学，在造血类器官（hematopoietic organoids, HEMOs）中重建高分辨率时空克隆动态，解析细胞命运决定的调控逻辑与空间克隆结构。

详细研究流程

研究共包含以下几个主要环节：

第一环节：基于LARRY的早期类器官谱系追踪。 研究者对预分化的人扩展多能干细胞（hEPSC）进行LARRY慢病毒感染（MOI=0.1），随后通过悬滴法形成拟胚体（EBs）并诱导分化为HEMOs。实验分两批独立进行，分别于第4天（D4）和第8天（D8）收获类器官，进行10x Genomics单细胞RNA测序（scRNA-seq）与LARRY条形码测序。D4数据集包含4,659个细胞，被分配至2,453个克隆（其中65%为单细胞克隆，排除后剩余857个克隆）；D8数据集包含2,698个细胞，分配至1,391个克隆（排除单细胞克隆后为347个克隆）。研究采用Harmony算法进行批次校正，验证了细胞类型注释的一致性。随后利用CoSpar进行克隆命运分析，利用RNA velocity推断分化方向，并利用cell2fate进行基因模块分解。

第二环节：mtDNA变异识别流程的基准测试（benchmarking）。 研究者生成了D8、D15、D18三个时间点的Chromium-MAESTER数据集及一个原始MAESTER研究中的造血数据集，对mquad与maegatk两种变异识别流程进行系统比较。mquad在每个类器官数据集中识别出41–44个变异，并通过δBIC累积分布的拐点确定信息性变异的截断值。maegatk采用≥3 UMI reads和>1% VAF的筛选标准，并使用clValid包进行聚类验证。结果显示，mquad识别的变异在热图中表现出更高的克隆特异性，Davies-Bouldin指数显著低于maegatk（表明聚类更紧致），因此mquad被选定为后续分析的变异识别和克隆推断工具。

第三环节：LARRY-MAESTER整合分析与克隆校正。 研究者对D4和D8的HEMO同时进行LARRY条形码测序与MAESTER线粒体变异富集，生成LARRY-MAESTER文库。mquad在D4数据中识别出35个高置信线粒体变异，D8中识别出29个。基于独特的线粒体变异组合，D4样本被划分为3个克隆（clone_A0、A1、A2），分别由变异6321G>A、6699G>A和7402C>A特异性标记。研究者比较了LARRY克隆身份与线粒体克隆身份的一致性，发现52%的克隆身份存在不一致；在LARRY定义的多谱系克隆中，58.1%含有多个线粒体亚克隆，属于LARRY条形码同质性（homoplasy）造成的假阳性。

第四环节：空间转录组学中的线粒体克隆定位。 研究者首先在软骨肉瘤（chondrosarcoma）样本中验证了Visium-MAESTER流程的可行性。mquad识别出24个信息性线粒体变异，将1,344个细胞划分为16个克隆，其中变异10310A>G有效区分了正常组织克隆（clone 5）与肿瘤克隆（clone 11），且spatialDE分析证实该变异的表达具有显著的空间依赖性。随后，研究者将此流程应用于D15的HEMOs，对5个类器官样本进行Visium空间转录组测序与线粒体变异富集。共识别出22个信息性变异，vireoSNP将细胞划分为3个克隆（clone 0、1、2）。定量空间分析显示：clone 0距组织边界最近（140.02±75.87像素），呈边缘分布；clone 2最为居中（3/5个类器官中被判定为中央克隆）；所有克隆的Moran’s I均为正值（p < 0.001），表明空间分布具有显著的非随机聚集性。

第五环节：Notch信号通路的功能验证。 研究者利用CellPhoneDB对clone 1内fibro与yse之间、clone 2内mes-like与EMP之间的配体-受体互作进行分析，发现DLK1-NOTCH1信号在空间上共表达于特定微环境中。免疫荧光染色进一步确认了DLK1⁺造血细胞与NOTCH1⁺非造血细胞的空间毗邻关系。为验证Notch信号的因果作用，研究者使用γ-分泌酶抑制剂DAPT处理HEMOs，于第12天进行流式细胞术分析。结果显示DAPT处理使CD34⁺CD45⁺细胞比例从14.1%降至0%，CD34⁺CD43⁺从22.3%降至2.48%，差异具有统计学显著性（p < 0.01）。所有组别的细胞存活率均高于80%，排除了非特异性细胞毒性效应。

主要结果

D4早期命运决定。 CoSpar分析显示42%的LARRY克隆为单谱系，58%为多谱系。谱系耦合分析揭示mes-like与EC及fibro之间存在最强的非随机耦合关系。RNA velocity分析显示mes-like群体呈现向EC特化的显著偏向，而mes-ps群体则主要向fibro方向分化。拟时序分析将mes-like定位为分化连续体中的祖细胞状态。免疫荧光实验证实了时间序列：D4时α-SMA⁺成纤维细胞已经出现而CD31⁺内皮细胞几乎缺失，D8时CD31⁺内皮细胞从PDGFRα⁺间充质祖细胞池中涌现，活体成像捕捉到间充质祖细胞向成纤维细胞和内皮细胞的双能分化过程。

基因模块动态。 cell2fate共识别出14个基因表达模块（module 0–13）。Module 0在所有早期细胞类型中普遍激活，代表原始增殖状态；module 1特异性激活于psc-ect群体，保留naive多能性标志基因；module 3同时激活于mes-ps和部分psc-like群体，富集转录调控程序；module 11特异性标记mes-like细胞，富集心脏右心室形态发生和主动脉瓣发育等器官发生术语；module 12驱动EC命运获得，富集平滑肌细胞分化和髓系细胞分化调控；module 13在EC亚群中高表达，富集髓系分化和造血相关基因集，符合生血内皮（hemogenic endothelium）的分子特征。Module 10、11、12的互斥激活模式为mes-like→fibro/EC的双向分化提供了转录调控层面的机制解释。

线粒体变异校正后的克隆动态。 在D4数据中，线粒体变异校正后单谱系克隆比例增加，多谱系克隆多样性下降。48%的LARRY克隆与线粒体克隆完全一致，这些克隆在UMAP中呈现更清晰的细胞类型边界。校正后的RNA velocity分析显示fibro谱系的分化方向更加明确。ZEB2被鉴定为介导mes-like向成熟EC转变的潜在驱动基因。在D8数据中，EC-fibro耦合持续存在，同时出现EMP-EC之间的中等程度耦合，提示生血内皮样活性。

空间克隆结构。 Clone 0位于类器官边缘，富含tb-like（21.1%）和yse（21.5%）等胚外谱系；clone 2位于核心区域，含有mes-like（23.1%）、tb-like（22.7%）、yse（26.8%）及少量HPC（1.95%）；clone 1呈中间分布，以yse和fibro为主，间充质祖细胞活性较低。研究者将这种模式总结为“干性许可的边缘与分化活跃的核心”。Notch信号的空间分析显示DLK1在clone 1的yse和clone 2的EMP中高表达，而NOTCH1在对应的fibro和mes-like中高表达，形成了空间上偶联的配体-受体信号对。

结论与意义

该研究建立了以线粒体DNA变异为内源性遗传记录器的多模态框架，实现了对HEMO发育过程中高分辨率时空克隆动态的重建。研究揭示了近60%的LARRY多谱系克隆实为条形码同质性所致的技术假象，证明了线粒体变异作为正交验证工具在提高谱系追踪准确性方面的关键价值。更为重要的是，该研究首次在发育中的人类类器官模型中展示了克隆空间分区现象，并将其与Notch介导的基质-祖细胞交互机制联系起来。DAPT抑制实验证实Notch信号对于生血谱系的建立和向成熟血细胞的推进具有因果必要性。该框架为研究人类发育、疾病建模及再生医学中组织自组织的克隆机制提供了新的技术基础和概念框架。

研究亮点

本研究的创新性体现在三个方面：第一，首次将线粒体变异谱系追踪与空间转录组学相结合，在保留空间位置信息的同时实现克隆鉴定；第二，通过系统基准测试确立了mquad在克隆信息性变异识别方面优于maegatk的定量证据；第三，发现并实验验证了“边缘干性维持-核心分化激活”的空间克隆分区模式及其Notch信号依赖的调控机制。该研究还展示了线粒体变异在癌症样本中区分正常与肿瘤克隆的应用潜力，提示该方法在发育生物学和肿瘤演化研究中均具有广泛的适用前景。