双波长表面等离子体共振显微镜结合激光诱导气泡细胞穿孔技术：新型单细胞操控与实时监测平台研究报告

作者与发表信息

本研究的通讯作者为广东工业大学的Youjun Zeng、法国特鲁瓦技术大学的Shuwen Zeng及东莞理工学院的Yufeng Yuan，合作作者包括Zhenxiao Niu、Hao Du等。研究成果发表于Analytical Chemistry期刊，收录于2025年7月，DOI编号为10.1021/acs.analchem.5c03900。

学术背景

研究领域：本研究属于生物物理与生物医学工程交叉领域，聚焦于单细胞膜穿孔技术（single-cell membrane perforation）的精准操控与实时监测。

研究动机：现有单细胞穿孔技术面临两大挑战：
1. 时空精度不足：传统化学或电穿孔方法难以实现单细胞级别的精准操控；
2. 动态监测缺失：缺乏对穿孔与修复过程的非侵入式实时观测手段。

技术背景：
- 表面等离子体共振显微镜（SPRM, Surface Plasmon Resonance Microscopy）：一种无标记、高灵敏度的光学成像技术，可量化细胞-基底界面相互作用。
- 激光诱导气泡穿孔：通过飞秒激光在细胞膜附近产生瞬态微气泡，利用其机械力实现可控穿孔。

研究目标：开发一种结合双波长SPRM与激光诱导气泡穿孔的集成平台，实现单细胞级别的精准穿孔与实时动态监测。

研究流程与方法

1. 双波长SPRM平台构建

核心创新：
- 光学设计：采用双LED光源（600 nm和650 nm）搭配窄带滤光片，通过Y型光纤耦合入射光，利用偏振器生成p偏振光激发表面等离子体共振（SPR）。
- 算法开发：提出双波长拟合算法（dual-wavelength fitting algorithm），仅需两个波长点的反射光强即可重构SPR光谱，计算共振波长（RW, Resonance Wavelength），时间分辨率达0.1秒/帧。
- 性能验证：
- 动态范围：通过不同浓度NaCl溶液测试，证实平台可检测折射率变化范围达0.111 RIU（折射率单位）。
- 空间分辨率：水平方向3.96 μm，垂直方向4.43 μm。

2. 激光诱导气泡穿孔系统

实验配置：
- 激光参数：飞秒激光（波长1030 nm，脉冲宽度300 fs，重复频率0.1 MHz），通过50倍物镜聚焦于金膜表面。
- 气泡调控：激光功率35.4–75.2 mW时，气泡可逆生成与塌缩；功率>91.6 mW时气泡持续存在。
- 力学分析：气泡扩张产生的剪切力可诱导细胞膜瞬时穿孔，直径10 μm的气泡可实现最佳穿孔效果。

3. 细胞实验与动态监测

研究对象：
- A549细胞（非小细胞肺癌细胞系）：用于实时监测胰蛋白酶消化过程中的细胞 detachment 动态。
- BT549细胞（三阴性乳腺癌细胞系）：用于激光穿孔与修复过程的实时成像。

实验流程：
1. 胰蛋白酶消化监测：SPRM记录A549细胞在胰蛋白酶作用下的RW变化，揭示细胞从边缘到中心的逐步 detachment 过程（图4）。
2. 激光穿孔动态观测：
- 穿孔阶段：气泡扩张导致细胞膜局部RW下降（如BT549细胞中心区域RW降低20.93 nm，图6d）。
- 修复阶段：180秒后细胞膜完整性恢复，RW回归基线水平（图6e）。

主要研究结果

1. SPRM平台的性能优势

• 高时空分辨率：0.1秒/帧的RW成像能力，可捕捉细胞膜穿孔与修复的瞬态过程。
  
• 无标记成像：避免荧光标记对细胞活性的干扰，适用于长期动态监测。
  
• 低成本配置：相比传统光谱扫描SPRM，双LED光源与算法显著降低系统复杂度。
  

2. 激光穿孔的精准控制

• 可控性：通过调节激光功率（35.4 mW）可实现可逆穿孔，细胞存活率高。
  
• 机制解析：气泡塌缩产生的机械力（非热效应）是穿孔主因，最小化光毒性。
  

3. 单细胞动态响应

• 胰蛋白酶消化：SPRM显示细胞边缘RW首先下降，逐步向中心扩散（图4c），揭示酶解动力学。
  
• 穿孔修复：BT549细胞在气泡作用后，膜完整性在3分钟内完全恢复（图6e），证实细胞的自修复能力。
  

研究结论与价值

科学意义

1. 方法学突破：首次将双波长SPRM与激光穿孔技术结合，为单细胞操控与实时监测提供新范式。
   
2. 机制阐释：揭示了气泡力学对细胞膜穿孔与修复的动态影响，补充了现有膜生物物理学理论。
   

应用价值

• 精准医疗：可用于癌症细胞靶向药物递送或基因编辑的实时优化。
  
• 基础研究：为细胞力学响应、膜修复机制等研究提供工具。
  

研究亮点

1. 技术创新：
   
   • 双波长SPRM算法将光谱扫描时间从秒级缩短至亚秒级。
     
   • 激光-气泡穿孔技术实现单细胞级别的空间选择性操控。
     
2. 跨学科融合：结合光学工程、生物物理学与微纳操控技术，推动活细胞研究方法的革新。
   

其他价值

• 扩展性：平台可适配植物细胞（如洋葱表皮细胞，图S5）或其他粘附细胞的研究。
  
• 临床潜力：文中提出SPRM在循环肿瘤细胞（CTC）检测、免疫细胞功能分析等领域的应用前景（如无标记区分癌细胞亚群）。
  

（注：文中所有实验数据与图表均引自原文献，具体细节可参考原文及补充材料。）