软骨细胞在缺氧微环境中通过染色质重编程激活CADM1-AS1/HDAC1复合物介导的抗炎信号

一、 研究团队、期刊与发表时间

本研究由浙江大学医学院附属邵逸夫医院骨科、浙江省肌肉骨骼系统退变与再生转化研究重点实验室的倪伟宇、顾天元、沈攀阳、梅子璇、吴依政、Kamuran Yilamu、潘楠、杨文韬、刘刚、马燕、方向前、范顺武、张海涛和沈淑颖等研究人员共同完成。该研究成果于2026年发表在学术期刊 Nature Communications 上，文章在线识别码（DOI）为：10.1038/s41467-026-71563-0。

二、 学术背景与研究目的

本研究属于骨关节炎（Osteoarthritis, OA）发病机制的分子生物学与表观遗传学交叉研究领域。骨关节炎是全球范围内导致残疾的主要原因，其特征是关节软骨进行性退变、软骨下骨硬化和骨赘形成。软骨细胞作为关节软骨中的常驻细胞，负责合成和维持细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM），其稳态对关节健康至关重要。软骨组织本身是无血管的，这导致软骨细胞在生理条件下处于缺氧微环境中。缺氧诱导因子（Hypoxia-inducible factors, HIFs，特别是HIF-1α）是细胞适应低氧环境的核心调控因子，在软骨细胞代谢和功能中扮演重要角色。然而，缺氧如何通过表观遗传机制精确调控软骨细胞稳态，特别是通过长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）介导的机制，尚不完全清楚。

近年来，表观遗传调控，尤其是组蛋白修饰（如组蛋白乙酰化）和增强子活性，在基因表达调控和疾病发生中的作用日益受到重视。同时，lncRNA作为重要的表观遗传调控分子，在多种疾病中显示出关键作用，但在骨关节炎缺氧响应中的具体功能和机制仍有待阐明。

本研究旨在探索缺氧条件下软骨细胞的表观遗传景观，识别调控骨关节炎发病的关键调控元件。具体目标包括：1）鉴定在缺氧条件下被激活的关键lncRNA；2）阐明该lncRNA调控软骨细胞功能和ECM稳态的分子机制；3）评估该lncRNA作为骨关节炎治疗靶点的潜力。

三、 详细研究流程

本研究采用了多层次、多技术的综合性研究策略，从表观基因组和转录组筛选到分子机制解析，再到体内外功能验证和潜在治疗策略探索。主要流程如下：

1. 缺氧响应性关键lncRNA的筛选与鉴定 * 研究对象与处理： 使用原代培养的人软骨细胞（Human Chondrocytes, HCs），分别在常氧（21% O₂）和缺氧（2.5% O₂）条件下培养24小时。 * 实验方法： * RNA测序（RNA-seq）： 对常氧和缺氧处理的HCs进行高通量转录组测序（Illumina平台），共鉴定出13,789个基因。通过差异表达分析，筛选出874个差异表达的mRNA和162个差异表达的lncRNA。 * 转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）： 分析常氧和缺氧条件下HCs染色质可及性的变化，鉴定差异染色质开放区域（差异峰）。 * 整合分析： 整合RNA-seq和ATAC-seq数据，寻找染色质可及性增加且转录水平同时上调的基因。结合H3K4me1和H3K27ac的CUT&Tag测序数据（用于标记活跃增强子），锁定受缺氧调控的增强子区域及其靶基因。 * 关键发现与后续聚焦： 通过上述多组学整合分析，研究人员发现了一个位于基因间区的增强子区域（Peak3），该区域在缺氧下染色质开放性和H3K27ac信号均增强。进一步分析表明，Peak3可能调控其下游约10kb的一个lncRNA——CADM1-AS1。染色体构象捕获（3C）实验证实了Peak3增强子与CADM1-AS1启动子区域在三维空间上存在物理相互作用。利用CRISPR-dCas9表观遗传编辑系统（dCas9-p300激活和dCas9-KRAB-MeCP2抑制）靶向Peak3区域，能分别上调和下调CADM1-AS1的表达，证实了Peak3是CADM1-AS1的超级增强子。此外，通过生物信息学预测和荧光素酶报告基因实验，证实HIF-1α（而非HIF-2α）通过结合Peak3附近的特定基序（Motif 3）来驱动CADM1-AS1在缺氧条件下的表达。

2. CADM1-AS1的表达与功能表征 * 研究对象： 人骨关节炎患者的软骨组织（受损区与未受损区配对样本）、不同月龄的野生型C57BL/6小鼠（自然衰老模型）、以及多种细胞系（人软骨细胞HCs、小鼠软骨细胞MCs、ATDC5细胞等）。 * 实验方法： * 表达分析： 通过RNA荧光原位杂交（FISH）、Northern blot、RT-qPCR等技术，在人和小鼠软骨组织及细胞中验证CADM1-AS1的表达定位（主要位于细胞核）及其在骨关节炎受损软骨和衰老小鼠软骨中的表达下调。 * 功能获得与功能缺失实验： * 体外： 在人和小鼠软骨细胞中使用反义寡核苷酸（ASO）敲低CADM1-AS1，或使用腺病毒（Ad）过表达CADM1-AS1。通过Western blot、RT-qPCR检测ECM合成相关基因（如SOX9、ACAN、COL2A1）和分解代谢基因（如MMP13、ADAMTS5）的表达变化。通过3D琼脂糖培养和阿辛蓝染色评估蛋白聚糖释放。 * 体内： * 条件性敲除（cKO）小鼠模型： 构建软骨细胞特异性（使用Acan-CreERT2和Col2-CreERT2驱动子）诱导性敲除CADM1-AS1的小鼠。通过内侧半月板失稳（DMM）手术诱导骨关节炎，评估关节疼痛行为学（热板实验、转棒实验）、Micro-CT（骨赘形成、骨微结构）、组织学染色（番红O/固绿，评估OARSI评分、Mankin评分、软骨下骨板厚度）来表型分析。 * 过表达模型： 通过关节腔内注射腺相关病毒（AAV）过表达CADM1-AS1，或在Rosa26位点构建全身性敲入（KI）小鼠，评估其在DMM模型或自然衰老模型中对骨关节炎的保护作用。 * 结果逻辑： 证实CADM1-AS1在骨关节炎中表达下调，且其下调与疾病严重程度相关。功能实验表明，CADM1-AS1能促进ECM合成、抑制ECM降解，在体内外均能缓解骨关节炎进展，是维持软骨稳态的关键因子。

3. CADM1-AS1的分子作用机制解析 * 研究对象： 小鼠软骨细胞（MCs）。 * 实验方法： * RNA pull-down与质谱分析： 使用生物素标记的CADM1-AS1 RNA从细胞裂解液中钓取结合蛋白，银染和质谱鉴定出多个组蛋白去乙酰化酶复合物（Histone Deacetylase Complex）的组分，包括HDAC1、HDAC2、RBAP48等。 * 结合验证： 通过Western blot验证RNA pull-down结果，通过电泳迁移率变动分析（EMSA）和RNA免疫共沉淀（RIP）证实CADM1-AS1与HDAC1存在直接相互作用。 * 分子对接与结构域分析： 通过计算模拟预测CADM1-AS1与HDAC1的结合位点，并通过点突变（将HDAC1的Asn21、Tyr23、Tyr24突变为丙氨酸）和CADM1-AS1截短体（删除120-250 nt茎环结构）实验，证实了结合的关键结构域。 * 靶基因鉴定与调控机制： 对过表达CADM1-AS1的MCs进行RNA-seq，发现一氧化氮合酶2（NOS2）是下调最显著的基因之一。通过染色质免疫共沉淀（ChIP）-qPCR和CUT&Tag-qPCR，发现CADM1-AS1过表达能增加HDAC1在NOS2启动子区域的富集，并降低该区域组蛋白H3K27的乙酰化（H3K27ac）水平。染色质分离RNA纯化（ChIRP）实验和点杂交（Dot blot）实验进一步证实CADM1-AS1通过其特定序列（205-215 nt）与NOS2启动子区域（-872至-862 nt）直接碱基配对结合。 * 代谢组学分析： 对过表达CADM1-AS1的软骨细胞进行靶向代谢组学分析，并使用稳定同位素标记的¹³C-精氨酸进行追踪，检测精氨酸代谢通路的变化。 * 结果逻辑： 阐明了CADM1-AS1作为“支架”分子，直接结合HDAC1并将其招募到NOS2基因的启动子区域。这种招募导致NOS2启动子区组蛋白去乙酰化（H3K27ac水平降低），从而抑制NOS2的转录。NOS2是催化精氨酸产生一氧化氮（NO）和瓜氨酸的关键酶。CADM1-AS1通过抑制NOS2，减少了精氨酸向瓜氨酸和NO的转化，从而可能影响软骨细胞的炎症和代谢状态。

4. 基于CADM1-AS1的治疗策略探索 * 研究方法： * 载体构建： 构建了基于snoRNA载体（snoVector）的CADM1-AS1过表达质粒，该载体能使RNA在细胞核内稳定积累。 * 工程化外泌体递送系统： 开发了一种杂交外泌体（Hybrid Exosome）递送系统。首先，通过基因工程在树突状细胞（DCs）的外泌体膜蛋白LAMP2B的N端融合了软骨细胞亲和肽（CAP），赋予外泌体软骨细胞靶向性。然后，通过孵育将含有CADM1-AS1 snoVector的质粒装载到这些工程化外泌体中，形成“杂交外泌体”。 * 体内治疗实验： 在DMM手术诱导的小鼠骨关节炎模型中，关节腔内注射装载CADM1-AS1的杂交外泌体，评估其对软骨破坏的缓解效果（组织学评分、Micro-CT）。 * 结果逻辑： 证明这种靶向性杂交外泌体递送系统能有效将CADM1-AS1递送至关节软骨，并在小鼠骨关节炎模型中显著减轻软骨退变，展示了一种潜在的治疗应用前景。

四、 主要研究结果

1. 鉴定出缺氧响应性lncRNA CADM1-AS1及其上游增强子： 通过多组学分析，发现了一个受HIF-1α调控的超级增强子（Peak3），该增强子在缺氧条件下激活，并远程调控lncRNA CADM1-AS1的表达。CADM1-AS1在人和小鼠骨关节炎软骨中表达下调，其下调与疾病严重程度正相关。
2. 证实CADM1-AS1对软骨稳态的保护作用： 在软骨细胞中敲低CADM1-AS1导致ECM分解代谢基因（MMP13, ADAMTS5）上调，合成代谢基因（SOX9, ACAN, COL2A1）下调。在软骨细胞特异性敲除CADM1-AS1的小鼠中，DMM手术或自然衰老诱导的骨关节炎显著加剧，表现为更严重的软骨破坏、骨赘形成和软骨下骨改变。反之，过表达CADM1-AS1（通过AAV或KI小鼠）能有效缓解骨关节炎表型。
3. 阐明CADM1-AS1通过招募HDAC1复合物抑制NOS2转录的分子机制： CADM1-AS1主要定位于细胞核，其120-250 nt的茎环结构直接与组蛋白去乙酰化酶HDAC1结合。CADM1-AS1作为“分子向导”，将HDAC1复合物招募至炎症基因NOS2的启动子区域，导致该区域组蛋白H3K27去乙酰化，从而抑制NOS2的转录。
4. 揭示CADM1-AS1调控精氨酸代谢： CADM1-AS1通过抑制NOS2，减少了软骨细胞中精氨酸向瓜氨酸和NO的转化。代谢组学和稳定同位素示踪实验证实，过表达CADM1-AS1导致细胞内精氨酸水平升高，瓜氨酸水平降低。临床样本分析发现，骨关节炎患者关节液中精氨酸/瓜氨酸比值随疾病严重程度增加而显著变化，提示其可能作为潜在的生物标志物。
5. 开发并验证基于CADM1-AS1的靶向治疗策略： 成功构建了携带软骨细胞靶向肽（CAP）的工程化杂交外泌体，用于递送CADM1-AS1 snoVector。体内实验证明，关节腔注射该杂交外泌体能有效将CADM1-AS1递送至软骨，并显著减轻DMM模型小鼠的软骨损伤。

五、 研究结论与价值

本研究系统性地揭示了一个由缺氧微环境触发、由HIF-1α介导、通过增强子激活lncRNA CADM1-AS1表达，进而调控软骨细胞表观遗传状态和代谢功能的新信号轴。核心结论是：CADM1-AS1通过招募HDAC1复合物至NOS2启动子，抑制其转录，减少NO产生，从而发挥抗炎和维持软骨细胞稳态的作用。CADM1-AS1的下调参与了骨关节炎的发病进程。

科学价值： 1. 机制创新： 首次将缺氧微环境、增强子重编程、lncRNA介导的表观遗传调控、组蛋白去乙酰化以及氨基酸代谢（精氨酸-NO通路）在骨关节炎软骨细胞功能障碍中联系起来，提供了一个全新的、整合性的分子机制框架。 2. 靶点发现： 明确了CADM1-AS1是一个关键的软骨保护因子和潜在的骨关节炎治疗靶点。 3. 范式拓展： 为研究组织特异性、微环境依赖性的表观遗传调控提供了范例，强调了非编码RNA作为“表观遗传支架”在整合环境信号与基因表达中的重要作用。

应用价值： 1. 诊断潜力： 关节液中精氨酸/瓜氨酸比值可能作为评估骨关节炎严重程度的潜在生物标志物。 2. 治疗策略： 开发的软骨靶向杂交外泌体递送系统，为将lncRNA等核内作用的核酸药物递送至软骨细胞提供了一种有前景的技术方案，具有临床转化潜力。 3. 药物开发： CADM1-AS1本身或其激活剂、以及其介导的HDAC1/NOS2通路中的关键节点，都可能成为开发骨关节炎疾病修饰疗法（Disease-Modifying Osteoarthritis Drugs, DMOADs）的新靶标。

六、 研究亮点

1. 多组学驱动的发现： 研究始于无偏见的全基因组表观遗传和转录组筛查（ATAC-seq, RNA-seq, CUT&Tag），成功从海量数据中定位到关键增强子及其靶lncRNA CADM1-AS1，体现了系统生物学的研究思路。
2. 机制研究的深度与完整性： 研究从上游缺氧信号（HIF-1α）、增强子调控（CRISPR-dCas9表观编辑）、lncRNA功能（体内外敲除/过表达）、相互作用蛋白（RNA pull-down, EMSA, RIP）、下游靶基因（RNA-seq, ChIRP, Dot blot）到最终代谢产物（代谢组学、稳定同位素示踪）进行了环环相扣、层层深入的验证，逻辑链条完整且严谨。
3. 创新性的治疗递送系统： 针对lncRNA需在细胞核内发挥功能的特点，创造性结合了snoRNA核滞留载体和工程化（软骨靶向）杂交外泌体递送技术，为解决关节腔内核酸药物递送效率低、靶向性差的难题提供了新方案，并进行了有效的体内验证。
4. 临床关联性： 研究不仅在细胞和动物模型上阐明了机制，还通过分析患者软骨样本和关节液，将基础研究发现与人类疾病病理变化和潜在诊断指标联系起来，增强了研究的临床相关性。

七、 其他有价值的内容

研究还指出，虽然DMM模型是研究骨关节炎的常用工具，但其人为诱导的、相对简单的病理过程与人类骨关节炎的渐进性发展存在本质区别。此外，研究中未观察到显著的滑膜炎，但作者也引述文献指出小鼠DMM模型的滑膜炎症可能是短暂且局限的。这些讨论体现了研究者对模型局限性的客观认识，并指出未来研究需要结合人体组织验证和更敏感的检测方法，以全面评估CADM1-AS1在骨关节炎中的抗炎潜力。这为后续研究的深化和临床转化指明了方向。