益生菌胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）生产的生物加工策略：培养条件调控的学术研究报告

一、作者与发表信息
本研究由Qingyu Lei（悉尼大学药学院）、Shiva Kamini Divakarla（悉尼大学与Biomecentric Pty Ltd联合培养）、Tristrom Winsley（Biomecentric Pty Ltd）、Shaun Roux（Biomecentric Pty Ltd）及Wojciech Chrzanowski（悉尼大学、卡罗林斯卡医学院与乌普萨拉大学）共同完成，发表于Frontiers in Bioengineering and Biotechnology期刊，2024年8月30日。

二、学术背景
科学领域：本研究属于微生物学与生物工程的交叉领域，聚焦于益生菌衍生的胞外囊泡（EVs）的生产优化与功能调控。
研究动机：益生菌（如乳酸杆菌）的胞外囊泡（Lactobacillus-derived EVs, LREVs）具有优于益生菌本身的免疫调节能力，但其生产机制与功能受培养微环境影响尚不明确。传统培养方法（如100%培养基浓度）可能导致污染物共分离，干扰LREVs的纯化与功能研究。
研究目标：通过调控培养条件（pH、生长时间、培养基浓度），优化LREVs的产量、纯度及功能，并建立其与宿主细胞（如角质形成细胞）和病原体（如金黄色葡萄球菌）的相互作用模型。

三、详细工作流程
1. 益生菌培养与条件调控
- 研究对象：以Lacticaseibacillus rhamnosus为模型益生菌，初始培养于传统条件（100% MRS肉汤，pH 5.5）。
- 变量设计：
- pH：3.5（酸性）、5.5（中性）、7.5（碱性）。
- 生长时间：48小时与72小时。
- 肉汤浓度：50%与10%原浓度。
- 监测方法：通过OD600测定细菌生长曲线，原子力显微镜（AFM）和3D细胞成像观察形态变化。

1. LREVs分离与纯化

   • 步骤：
     
     1. 离心（8,000 g，10分钟）去除细菌。
        
     2. 0.45 µm滤膜过滤去除碎片。
        
     3. 切向流过滤（TFF-easy™系统）浓缩并置换缓冲液（0.01 M HEPES）。
        
   • 对照组：无益生菌的纯肉汤经相同步骤处理，作为污染物对照。
     

2. LREVs表征

   • 物理特性：
     
     • 纳米流式分析（NanoFCM）：测定粒径（40–200 nm）、分布及浓度。
       
     • 稳定性评估：4℃储存4周，通过电阻脉冲传感（TRPS）分析粒径与Zeta电位变化。
       
   • 生物组成：
     
     • 蛋白质：BCA法检测。
       
     • 碳水化合物：酚硫酸法。
       
     • 脂质：硫代磷酸香草醛法（SPVA）。
       
   • 元素分析：ICP-MS检测Ca、P、Zn等元素含量。
     

3. 功能评估

   • 细胞毒性：人表皮角质形成细胞（HaCaT）暴露于LREVs（10²–10⁴ EVs/细胞），CCK-8法检测细胞活力。
     
   • 抗菌活性：最小抑菌浓度（MIC）测试，评估LREVs对Staphylococcus aureus的抑制作用。
     

四、主要结果
1. 培养条件对LREVs生产的影响
- 肉汤浓度：10%肉汤显著减少污染物（降幅95%），但50%肉汤在pH 3.5时LREVs产量最高（6.64×10¹⁰ vesicles/mL）。
- pH：酸性条件（pH 3.5）促进LREVs释放，中性条件（pH 5.5）优化抗菌功能。
- 生长时间：72小时培养增加LREVs产量（如pH 5.5时提升3.68倍），但延长时间可能降低纯度。

1. LREVs的理化特性

   • 纯度验证：Triton X-100处理后，50%肉汤组LREVs颗粒数下降90%（pH 3.5），证实高纯度；而100%肉汤组因污染物干扰无显著变化。
     
   • 元素组成：LREVs富含磷（P）与钾（K），其中P含量在50%肉汤组比肉汤对照组高16.6倍（pH 3.5）。
     

2. 功能验证

   • 安全性：LREVs对HaCaT细胞无毒性（活力>80%），而肉汤污染物导致细胞形态改变（如伸长）。
     
   • 抗菌活性：pH 5.5条件下生产的LREVs显著抑制S. aureus生长（降幅28–39%），且独立于肉汤成分。
     

五、结论与价值
1. 科学意义：揭示了培养微环境（pH、营养压力）通过调控益生菌应激反应，影响LREVs的产量、组成及功能，为定制化EVs生产提供理论依据。
2. 应用价值：优化的培养条件（如50%肉汤、pH 3.5）可规模化生产高纯度LREVs，适用于皮肤感染治疗（如抗菌敷料）或肠道免疫调节。

六、研究亮点
1. 方法创新：首次系统评估肉汤浓度对LREVs纯化的影响，提出降低污染物策略。
2. 发现新颖：酸性pH（3.5）联合营养限制（50%肉汤）可协同提升LREVs产量。
3. 功能导向：证明LREVs的抗菌功能依赖于培养条件，非单纯肉汤成分作用。

七、其他价值
本研究建立的“条件-功能”关联模型可拓展至其他益生菌EVs研究，如Lactobacillus plantarum的EVs抗生物膜应用。