《Advanced Mammalian Cell Culture Techniques: Principles and Practices》是一本由K.M. Ramkumar、R. Senthilkumar和Md Enamul Hoque共同编辑的实用实验室手册，由CRC Press于2024年首次出版。本书旨在为生命科学、生物技术、遗传学和分子生物学领域的学生、研究人员和从业者提供哺乳动物细胞培养基础与高级技术的系统性指导。

作者及背景

三位主编均具有丰富的学术背景： - K.M. Ramkumar 是印度SRM理工大学生物技术学院教授，研究方向为糖尿病细胞信号网络和表观遗传调控。 - R. Senthilkumar 是印度Reva大学生物技术系副教授，专注于G蛋白偶联受体信号通路研究。 - Md Enamul Hoque 是孟加拉国军事理工大学生物医学工程系教授，擅长生物材料和组织工程。

本书分为四大章节，涵盖从基础细胞培养到下游应用的完整技术链条，包括核酸与蛋白质分离、细胞染色技术、细胞转染和单细胞分析等。

核心内容

1. 细胞培养基础（Section 1）

• 历史与里程碑：回顾了从1885年Wilhelm Roux的鸡胚胎培养到现代3D生物打印技术的演进，强调了单克隆抗体生产和条件性永生化技术（conditional immortalization）等突破。
• 无菌技术：详细描述II级生物安全柜（Class II BSC）的操作规范，包括70%乙醇消毒、紫外线灭菌和气流管理。
• 培养基制备：对比了限定培养基（defined media，如DMEM）与非限定培养基（undefined media，含胎牛血清FBS）的配方差异，并提供了500ml完全培养基的配制流程（含10% FBS和2mM L-谷氨酰胺）。
• 原代细胞培养：从组织解离（0.25%胰蛋白酶/EDTA消化）到传代的关键步骤，指出胚胎组织因细胞活力高更适合作原代培养。

2. 核酸与蛋白质分析（Section 2）

• RNA提取：采用Trizol法分离总RNA，并通过Qubit 3.0分析仪检测纯度（A260/A280比值）。
• 蛋白质检测：Bradford法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳（12%分离胶）和免疫印迹（Immunoblotting）技术，特别强调RIPA缓冲液裂解细胞时需加入蛋白酶抑制剂。

3. 细胞染色技术（Section 3）

• 核染色：DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色观察细胞核形态。
• 免疫荧光：一抗（如抗α-微管蛋白）孵育后，Cy3标记二抗显色。
• 活性氧检测：H2DCFDA探针标记细胞内ROS（活性氧簇），流式细胞术定量分析。

4. 细胞转染与单细胞分析（Section 4）

• 报告基因构建：以荧光素酶（Luciferase）为例，详细说明载体选择（如pGL3-basic）和启动子插入策略。
• 单细胞分选：FACS（荧光激活细胞分选）技术分离CD34+造血干细胞，分辨率达单个细胞级别。

学术价值

1. 技术整合性：首次系统整合从传统培养（如原代细胞传代）到前沿技术（如单细胞RNA测序准备工作）。
2. 实操指导：每个实验均包含“关键点”（Key Points）提示，例如胰蛋白酶消化时间需控制在2-10分钟以避免细胞损伤。
3. 安全规范：专章讨论实验室安全，包括生物安全等级（BSL-1至BSL-4）的划分标准和液氮储存的操作风险。

亮点

• 3D培养应用：介绍糖尿病皮肤模型（3D bioprinting of diabetic human skin）的构建方法，模拟病理微环境。
• 问题解决导向：针对常见污染（如支原体）提供PCR检测方案（引物序列靶向16S rRNA基因）。
• 跨学科衔接：将细胞培养技术与下游分子生物学分析（如qRT-PCR）无缝衔接。

本书通过分步式Protocol和理论原理的结合，既适合初学者建立标准化操作框架，也能为高级研究者提供技术优化思路。其强调的“从基础到应用”过渡模式，尤其在基因编辑（如CRISPR-Cas9转染）与疾病模型构建方面具有显著的教学与科研价值。