由中国人民解放军空军军医大学（第四军医大学）基础医学院微生物与病原生物学系的张芳林、雷迎峰、徐志凯以及西京医院麻醉与危重症医学科的张西京等共同领导的研究团队，在《自然·通讯》（Nature Communications）期刊2024年卷15期438号发表了题为“Disparate macrophage responses are linked to infection outcome of Hantaan virus in humans or rodents”的研究论文。这项研究深入揭示了汉坦病毒（Hantaan virus， HTNV）在自然宿主啮齿动物和人类感染者中导致迥异感染结局的关键免疫机制，即巨噬细胞反应差异在其中扮演决定性角色，并首次发现了一条由小鼠特异性长链非编码RNA（long noncoding RNA， lncRNA）构成的免疫“刹车”通路。

学术背景

汉坦病毒是全球范围内分布的人畜共患病原体，可引起两种严重的疾病：流行于欧亚大陆的肾综合征出血热（Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome， HFRS）和美洲的汉坦病毒肺综合征。汉坦病毒（HTNV）是HFRS的原型病毒，其自然宿主为黑线姬鼠等啮齿动物。一个长期困扰科学界的核心问题是：为何该病毒在其啮齿动物宿主中通常呈无症状携带状态，而在感染人类后却可能引发致死性的HFRS？此前研究提示，细胞因子风暴综合征（cytokine storm syndrome）是HFRS发病的关键，而在自然宿主中仅观察到轻微的免疫病理损伤，但决定宿主抗病毒反应强度的深层机制尚不明确。

巨噬细胞作为宿主单核吞噬系统的重要组成部分，具有高度的可塑性和异质性，是免疫行动的“调节器”。经典促炎型（M1）和替代性促消退型（M2）极化状态之间的平衡对感染结局至关重要。Notch信号通路和NF-κB通路在免疫调节中均发挥核心作用，但其在汉坦病毒感染中的交互关系及种间差异尚未阐明。此外，lncRNA作为重要的免疫调节分子，其序列保守性较低，存在大量物种特异性成员，这为解释人类与啮齿动物免疫反应的差异提供了新的视角。基于以上背景，本研究旨在探究巨噬细胞反应差异是否是导致HTNV在人与鼠中感染结局不同的关键，并揭示其背后的分子机制。

详细研究流程

本研究是一项综合性极强的机制探索，融合了临床样本分析、动物模型、细胞实验以及多组学技术，流程可概括为以下几个核心环节：

1. 临床队列分析与现象确认：

   • 研究对象：收集了HFRS患者（不同疾病阶段和严重程度）、日本脑炎病毒（JEV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染者及健康人的外周血单个核细胞（PBMC）。
   • 研究方法与实验：通过流式细胞术系统分析了单核细胞亚群（经典、炎症性M1样、巡逻性M2样）的比例动态变化。使用Bio-Plex多因子检测系统分析了患者血清中40种细胞因子的谱式。通过细胞内染色评估单核细胞的细胞因子（TNFα， IL-8， IL-10）产生能力。
   • 数据分析：通过相关性分析，将单核细胞亚群比例、特定细胞因子阳性细胞比例与疾病严重程度、临床分期进行关联。

2. 自然宿主啮齿动物体内动态研究：

   • 研究对象：从中国渭河平原HTNV流行区捕获的黑线姬鼠，根据肺部病毒RNA水平和抗体产生情况，将其感染过程划分为阴性期（HINS）、早期（HIES）、进展期（HIPS）和清除期（HICS）。
   • 研究方法与实验：通过ELISA检测肺组织细胞因子（TNFα， IP-10等）水平。通过免疫印迹（Western Blot）分析肺泡巨噬细胞中NF-κB通路关键蛋白p65及其磷酸化、STAT1磷酸化的动态变化。利用免疫荧光观察肺泡巨噬细胞在肺组织中的募集和分布。

3. 巨噬细胞反应的种间差异体外验证与功能探索：

   • 研究对象：从小鼠（骨髓来源巨噬细胞BMDM， 腹腔巨噬细胞）和人类（单核细胞来源巨噬细胞）分离的原代巨噬细胞，以及小鼠（RAW264.7， MH-S）和人（THP-1来源）巨噬细胞系。
   • 研究方法与实验：用HTNV感染细胞，在不同时间点收集样本。通过ELISA检测上清中TNFα、IFNα等细胞因子的时序变化。通过免疫印迹、免疫荧光、活细胞成像、NF-κB荧光素酶报告基因实验、DNA结合实验等手段，详细比较了小鼠和人类巨噬细胞中p65的磷酸化（多个位点）、核转位及转录活性的动态模式。同时检测了STAT1， IRF5， IRF4等其他关键转录因子的活化情况。

4. 巨噬细胞功能在体内感染模型中的验证：

   • 研究对象：两种小鼠模型：对HTNV高度敏感的致死性乳鼠感染模型，以及对HTNV耐受的成年鼠无症状感染模型。
   • 研究方法与实验：使用氯膦酸盐脂质体（Clophosome）在体内清除单核/巨噬细胞，或在感染不同时间点给予TNFα中和抗体，观察对疾病进程（生存率、体重变化）、病毒载量和炎症反应的影响。

5. 次级细菌感染的序贯挑战模型：

   • 研究对象：成年小鼠。
   • 研究方法与实验：在HTNV感染的不同阶段（早期3天， 晚期7天），用脂多糖（LPS）或盲肠结扎穿刺（Cecal Slurry， CS）攻击小鼠，建立次级细菌败血症模型。评估小鼠生存率、体重、血清细胞因子、外周血及组织中M1样免疫细胞比例以及组织病理损伤，探究HTNV感染前期对后续细菌感染易感性的影响。

6. 机制探索：Notch信号通路与NF-κB通路的交互作用：

   • 研究对象：小鼠原代BMDM、巨噬细胞系以及条件性敲除Rbp-j（Notch通路关键转录因子）的小鼠。
   • 研究方法与实验：
     • 转录组测序（RNA-seq）：对HTNV感染不同时间点的小鼠BMDM进行测序，通过GO和KEGG富集分析筛选出显著变化的通路，特别是Notch信号。
     • 遗传与药理学干预：利用Rbp-j基因敲除（Rbp-j cKO）、过表达显性负性突变体R218H、γ-分泌酶抑制剂DAPT等工具，结合qRT-PCR、流式细胞术、ELISA、Seahorse能量代谢分析、线粒体功能检测等手段，系统评估Notch通路对巨噬细胞极化（M1/M2表型、细胞因子分泌、吞噬、趋化、抗原提呈、代谢重组）、NF-κB通路活化以及整体感染结局（乳鼠和成年鼠生存模型）的影响。
     • 动态监测：通过免疫印迹和免疫荧光，检测Notch受体、配体表达以及Notch胞内结构域（NICD）在细胞质和细胞核内的时空分布变化。

7. 关键分子发现：小鼠特异性lncRNA的筛选与功能鉴定：

   • 研究对象：Rbp-j cKO与野生型（WT）小鼠BMDM的RNA-seq数据，以及多种病毒（HTNV， 登革病毒2型DENV2， 仙台病毒SeV等）感染的巨噬细胞。
   • 研究方法与实验：
     • 筛选与验证：通过比较RNA-seq数据，筛选出97个在Rbp-j cKO中差异表达的小鼠特异性lncRNA。通过qRT-PCR验证其在HTNV及其他RNA病毒感染下的时序表达。利用生物信息学分析其编码潜能、序列保守性、组织表达谱和亚细胞定位（RNA荧光原位杂交FISH）。
     • 调控机制：通过启动子区序列分析、Rbp-j回补/突变实验、TLR通路基因沉默等，确认这些lncRNA受Notch-Rbp-j轴上游调控，且其表达依赖于TLR3/TLR4信号。
     • 功能缺失与获得：使用锁核酸（LNA）或小干扰RNA（siRNA）沉默候选lncRNA（22387.1， 30740.1， 30928.1），或外源过表达，通过多维度表型分析（流式、代谢、功能实验）评估其对巨噬细胞极化转换的影响。
     • 分子机制解析：聚焦于变化最显著的lncRNA 30740.1（命名为lnc-IP65）。通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）、免疫荧光共定位、构建p65及lnc-IP65截短体等实验，精确定位两者的相互作用区域。通过免疫印迹和活细胞成像，明确lnc-IP65缺失对p65多个位点（S276， S529， S536）磷酸化及核转位的影响。

8. 体内验证：lnc-IP65基因敲除小鼠模型：

   • 研究对象：利用CRISPR/Cas9技术构建的lnc-IP65全身敲除（lnc-IP65−/−）小鼠。
   • 研究方法与实验：在乳鼠和成年鼠模型中挑战HTNV，全面评估敲除鼠的疾病严重程度（生存率、体重）、系统性炎症（血清及组织细胞因子、组织病理、免疫细胞活化）、病毒复制情况以及疼痛敏感性变化。同时，在lnc-IP65−/−小鼠中建立LPS或CS诱导的败血症模型，评估其基础炎症状态。

9. 分子互作网络整合：

   • 研究方法与实验：通过免疫共沉淀（Co-IP）证明在HTNV感染早期，NICD能与IKKβ和p65直接结合。通过构建一系列截短体，精细绘制了NICD与IKKβ、p65的相互作用结构域。进一步证明lnc-IP65能够竞争性结合p65，从而破坏NICD-p65复合物，但不影响NICD-IKKβ结合。最后，在人类巨噬细胞中外源表达小鼠lnc-IP65，验证其能否重编程人类巨噬细胞的炎症反应。

主要研究结果

1. 临床现象：HFRS患者的炎症性单核细胞过度活化驱动细胞因子风暴。与JEV， HBV， HCV感染者相比，HFRS患者急性期外周血中炎症性M1样单核细胞（CD14++CD16+）比例显著升高，且其比例与疾病严重程度正相关。这些M1样单核细胞高表达TNFα， IL-8， IL-10和HLA-DR， 其中TNFα+单核细胞是疾病严重性的关键关联因素。患者血清中出现以TNFα为核心的20种细胞因子上调。

2. 种间核心差异：小鼠巨噬细胞存在晚期失活现象，而人类则持续活化。在自然感染HTNV的黑线姬鼠体内，炎症细胞因子（如TNFα， IP-10）水平在感染早期（HIES）升高，但在进展期（HIPS）迅速下降。其肺泡巨噬细胞中p65的磷酸化水平也呈现先升后降的波动模式。体外实验证实，小鼠巨噬细胞（原代及细胞系）感染HTNV后，p65的磷酸化、核转位及转录活性均在24小时左右达到峰值，随后显著下降；而人类巨噬细胞中p65的活化则持续增强。清除巨噬细胞在致死性乳鼠模型中改善预后，但在成年鼠耐受模型中却促进发病，提示巨噬细胞在不同模型中具有“破坏者”或“防御者”的双重角色。

3. 功能后果：小鼠巨噬细胞的晚期失活赋予其抵抗次级败血症的能力。预先感染HTNV（36小时）的小鼠巨噬细胞，在面对LPS二次刺激时，其p65活化和促炎因子（TNFα， IL-6， MCP-1）产生受到显著抑制。体内实验显示，处于HTNV感染晚期（7天）的小鼠能抵抗致死剂量的LPS或CS攻击，表现为炎症减轻、组织损伤改善和生存率提高；而早期（3天）感染则加剧败血症。

4. 核心机制：Notch信号动态调控小鼠巨噬细胞表型转换。RNA-seq提示Notch信号通路显著变化。Rbp-j敲除导致小鼠巨噬细胞在HTNV感染晚期无法下调M1相关基因（如Tnfα， Il6）表达，并持续高活化p65（而非STAT1）。Notch通路呈现独特的“两阶段”活化：早期（0-24小时），NICD在胞质积累但未大量入核；晚期（24-48小时），NICD核转位并驱动下游基因表达。Rbp-j敲除乳鼠和成年鼠对HTNV感染的敏感性均增加，出现更严重的炎症和组织损伤。

5. 人类对比：Notch信号持续活化促进炎症。在人类巨噬细胞中，Notch相关基因和蛋白在整个感染期间持续上调，NICD持续生成并转入核内。抑制Notch信号（用DAPT）会减弱p65活化和促炎因子产生，同时增强M2相关基因表达。

6. 关键分子发现：Notch下游的小鼠特异性lncRNA发挥免疫刹车功能。筛选出8个受Notch-Rbp-j轴调控、在HTNV感染晚期高表达的小鼠特异性lncRNA。沉默其中三个（22387.1， 30740.1， 30928.1）会阻碍巨噬细胞从促炎向促消退表型的转换，增强NF-κB活性和促炎功能。

7. lnc-IP65的精细机制：结合并抑制p65磷酸化。lnc-IP65能与p65直接结合，其结合区域覆盖p65的1-300aa和401-549aa， 这两个区域邻近关键的磷酸化位点（S276， S529， S536）。lnc-IP65通过空间位阻效应，抑制这些位点的磷酸化，从而阻止p65完全活化及核转位。其头部（1-1000 nt）和中部（1001-2000 nt）区域分别负责抑制S276和S529/S536的磷酸化。

8. 体内关键验证：lnc-IP65缺失导致致命性感染。lnc-IP65−/−小鼠在HTNV感染后表现出早期发病、高死亡率、严重的全身性炎症（细胞因子风暴、多器官免疫病理损伤、痛觉过敏），尽管其巨噬细胞呈现超强的M1活化和抗病毒状态，但未能控制病毒复制。lnc-IP65−/−小鼠也对LPS和CS诱导的败血症更敏感。

9. 分子网络整合：Notch-NF-κB-crosstalk与lnc-IP65的负反馈调节。在感染早期，HTNV诱导产生的NICD作为支架，通过其ANK结构域与p65结合，通过其RAM/ANK结构域与IKKβ的STKC结构域结合，从而促进IKKβ对p65的磷酸化和NF-κB通路的完全活化，驱动M1极化。在感染晚期，Notch-Rbp-j轴转录产生包括lnc-IP65在内的小鼠特异性lncRNA。lnc-IP65结合到p65上，竞争性取代NICD，破坏NICD-p65复合物，抑制p65的进一步磷酸化，使巨噬细胞表型从M1重编程为M2。这一负反馈环路在人类巨噬细胞中缺失。

结论与意义

本研究得出结论：巨噬细胞反应的种间差异是决定HTNV在人类引起致命性疾病而在啮齿动物中无症状携带的关键。其核心机制在于一条存在于小鼠而非人类的、由Notch信号通路启动的负反馈调节轴。HTNV感染早期通过Notch-NF-κB交互作用促进炎症性巨噬细胞（M1）极化；而在感染晚期，Notch通路诱导产生一系列小鼠特异性的lncRNA（以lnc-IP65为代表），这些lncRNA通过直接结合并抑制NF-κB关键转录因子p65的磷酸化，及时“刹住”过度的炎症反应，使巨噬细胞向促消退表型（M2）转换，从而避免细胞因子风暴，维持宿主耐受。而在人类中，由于缺乏此类lncRNA介导的负反馈机制，Notch-NF-κB驱动的炎症反应持续失控，最终导致严重的免疫病理损伤。

研究的价值与亮点

1. 科学价值：首次从巨噬细胞可塑性和物种特异性基因调控层面，系统阐明了汉坦病毒“宿主-病原体”相互作用中导致截然不同临床结局的完整分子机制图谱。将Notch信号通路、NF-κB通路和物种特异性lncRNA整合到一个清晰的调控网络中，深化了对病毒感染免疫病理与免疫调节的理解。
2. 应用价值：为HFRS及其他由过度炎症反应驱动的疾病（如脓毒症、细胞因子释放综合征）提供了新的潜在治疗策略。靶向Notch通路或模拟lnc-IP65的功能，可能成为控制病毒感染中过度炎症的新方法。同时，研究提示针对特定lncRNA的干预需要考虑物种差异。
3. 重要观点：提出了“免疫刹车”的概念，强调在抗感染免疫中，适时“关闭”炎症反应与启动反应同等重要。物种特异性非编码RNA是解释传染病临床表现种间差异的重要分子基础。
4. 研究亮点：
   • 发现新颖：首次发现并功能鉴定了在病毒感染的免疫调节中起关键作用的小鼠特异性lncRNA分子lnc-IP65。
   • 机制深入：从临床现象到动物模型，从细胞表型到分子互作（NICD-IKKβ-p65-lnc-IP65），研究层层递进，机制解析非常深入和精细。
   • 逻辑闭环：完整阐述了从“炎症启动”（Notch增强NF-κB）到“炎症刹车”（lncRNA抑制p65）的动态调控全过程，并解释了其物种特异性根源。
   • 模型系统全面：结合了自然感染宿主观察、基因工程小鼠模型、多种细胞模型以及次级感染挑战模型，证据链坚实。
   • 方法综合：娴熟运用了多组学、高分辨率活细胞成像、遗传操作、分子互作定位等多种前沿技术。

其他有价值内容

研究还提示，HTNV感染晚期的巨噬细胞重编程（M2倾向）可能影响宿主的代谢状态（如从