本文档为一项原创研究论文（类型a），以下为该研究的学术报告。

主要作者与研究机构

该研究由Guoyan Luo、Jia Song、Yongbo Fu等人共同完成，主要通讯作者为Weihong Tan（中国科学院杭州医学研究所）和Qin Wu（中国科学院杭州医学研究所）。研究发表于*Science*期刊，2026年1月1日，文章编号为eadv6127，DOI为10.1126/science.adv6127。

学术背景

细胞表面蛋白是临床上最重要的药物靶点与疾病生物标志物，超过60%的治疗药物以细胞表面蛋白为靶标。然而，针对这些靶标开发高亲和力分子探针（如核酸适配体）的方法仍然有限。传统的指数富集配体系统进化（SELEX）技术虽然已成功筛选出大量适配体，但在识别细胞表面蛋白的适配体靶标方面仍面临重大障碍。当前的靶标鉴定方法主要依赖适配体免疫沉淀联合质谱分析（Apt IP-MS），该方法通常需要超过10轮筛选才能获得足够富集，耗时长、资源消耗大，且偏向高丰度序列，导致低丰度蛋白常被忽略。此外，PCR偏差可能使具有优异结合性能的序列被排除。因此，亟需一种高通量、能在天然细胞环境中同时实现适配体发现与靶标识别的技术平台。

研究流程与实验方法

为克服上述局限，研究者开发了SPARK-Seq平台，即单细胞扰动驱动的适配体识别与动力学测序（single-cell perturbation-driven aptamer recognition and kinetics sequencing）。该平台整合了CRISPR基因扰动、单细胞mRNA测序和适配体测序三个组学层面。

实验首先构建了适配体文库，其核心为46个核苷酸的随机区，两侧分别连接32 nt的5′ PCR引物序列和22 nt的3′捕获序列。随后以SUM159PT细胞为靶细胞、MCF-10A细胞为反筛细胞，进行了四轮cell-SELEX富集，得到R4富集文库。通过流式细胞术验证了R4文库对靶细胞的结合能力。

在靶标选择阶段，研究者对各轮筛选文库进行了pull-down结合质谱分析，根据质谱结果和富集程度选择了13个表面蛋白作为CRISPR敲除靶标，包括NRP1、PTK7、PTPRF、NRP2、PTPRS、CD151、ITGB1、PTPRD、ITGA3、SLC25A5、RAB5C、RAB23和CDCP1。针对每个蛋白设计了3条不同的gRNA，共46条gRNA，另设7条阴性对照gRNA。将SUM159PT细胞经慢病毒转导构建混合敲除细胞群，与R4文库孵育后进行10x Genomics 5′端单细胞测序，同时捕获gRNA、mRNA和适配体序列。

数据分析依赖研究者自主开发的计算管线SPARTA（single-cell perturbation-aptamer recognition and targeted aptamer-generation algorithm）。分析流程包括：质控过滤低质量细胞和双细胞，共保留8466个高质量单细胞；提取高频适配体序列，将前10000条独特序列通过BLAST-short-MCL算法聚类为1906个适配体家族；对每个适配体家族在各gRNA定义细胞群中相对于阴性对照计算结合差异（binding difference）；利用高斯混合模型区分特异性与非特异性结合；最终通过评分系统确定适配体-靶蛋白配对。同时使用Mixscape算法过滤未真正发生基因敲除的细胞。

验证实验包括流式细胞术、表面等离子体共振（SPR）和微量热泳（MST）等正交方法。SPARTA框架还集成了基于卷积神经网络（CNN）的预测模块和基于变分自编码器（VAE）的生成模块，用于适配体预测与变异体生成。

主要研究结果

SPARK-Seq在单次实验中成功将5535条适配体序列映射到8个表面蛋白靶标，包括PTK7、ITGA3、CDCP1、NRP1、NRP2、PTPRD、PTPRF和PTPRS。12个适配体家族在相应靶标敲除细胞群中表现出显著的结合差异。其中，适配体家族1和15靶向PTK7；家族2、6、7靶向NRP1；家族11和14靶向NRP2；家族5、13、17靶向CDCP1；家族3识别ITGA3/ITGB1复合物；家族4同时结合PTPRD、PTPRF和PTPRS三个旁系同源蛋白。

正交验证证实了这些适配体-靶标配对的可靠性。流式细胞术显示代表性适配体仅结合靶蛋白阳性细胞而不结合敲除细胞；SPR和MST测定显示结合亲和力在纳摩尔至皮摩尔范围。对于跨靶标结合现象，研究者进一步证明apt-3-3直接靶向ITGA3而非ITGB1，apt-4-5能同时识别三个PTPR旁系同源蛋白但具有不同的动力学参数。通过竞争实验、pull-down和SPR交叉结合实验，证实了所获得适配体的高度特异性。值得注意的是，SPARK-Seq能区分高度同源的NRP1和NRP2蛋白，获得的适配体无交叉反应。

SPARK-Seq还展示了捕获跨越两个数量级蛋白丰度范围靶标的能力。定量流式细胞术显示ITGA3表面拷贝数超过10万/细胞，而PTPRD和PTPRF低于1000拷贝/细胞。SPARK-Seq成功识别了传统方法难以发现的低丰度靶标CDCP1。

动力学分析揭示SPARK-Seq优先富集慢解离速率（slow off-rate, 低koff）的适配体。对于PTK7靶向适配体，-log2FC与koff呈强相关（r² = 0.84–0.88），而与平衡解离常数KD无显著相关。这一规律在CDCP1、NRP1、NRP2、PTPRF等多个靶标中均得到验证。与传统基于最高拷贝数选择适配体的方法相比，SPARK-Seq识别的适配体解离速率约慢10倍，展现出明显的动力学优势。

基于SPARTA的CNN分类器在预测PTK7结合序列方面达到了约97%的准确率。生成模块产生的15个变异体中有12个在体外结合PTK7，其中一个变异体spark-apt-18表现出最慢的解离速率。

结论与科学价值

SPARK-Seq建立了一个集CRISPR基因扰动、单细胞转录组学和适配体测序于一体的高通量平台，并通过深度学习框架SPARTA实现了适配体预测与优化。该平台在天然细胞环境中以单细胞分辨率直接关联基因扰动、表达表型和适配体结合表型，克服了传统方法对高丰度蛋白的偏好，减少了PCR偏差和pull-down假象，能够发现构象敏感型靶标并优先筛选慢解离速率的适配体。

该研究为“适配体组学”（aptomics）奠定了基础，即将数百万适配体结合事件转化为与遗传和转录状态锚定的高维测序数据，实现跨数千个单细胞的基因型-表型-配体直接映射。在应用层面，SPARK-Seq可加速诊断和治疗用高特异性适配体的开发，慢解离速率特性对于体内成像、靶向药物递送和治疗性阻断具有重要意义。此外，通过基因组规模的CRISPR筛选，该平台有望系统性地绘制适配体与已知及未注释表面蛋白的相互作用图谱，并拓展至细胞内蛋白和错误定位蛋白的适配体发现。

研究亮点

本研究的核心创新包括三个方面：其一，技术方法学突破——将CRISPR筛选与单细胞多组学结合，实现在天然细胞环境中原位高通量发现适配体-靶标互作；其二，数据分析创新——开发SPARTA算法管线，集成聚类、差异分析和深度学习预测与生成功能；其三，生物学发现——揭示了SPARK-Seq对慢解离速率适配体的选择性富集规律，并证明了该平台能解析高度同源蛋白，捕获跨越两个数量级丰度范围的靶标。这些特点使SPARK-Seq成为适配体发现与理性设计领域的重要平台。