类型a：单篇原创研究的学术报告

作者及机构
本研究由Eamonn Kennedy（第一作者）、Zhuxin Dong（共同第一作者）、Clare Tennant和Gregory Timp（通讯作者）共同完成，研究团队来自美国圣母大学（University of Notre Dame）的电气工程系、化学工程系及生物科学系。该研究于2016年7月25日在线发表于Nature Nanotechnology期刊，标题为《Reading the primary structure of a protein with 0.07 nm³ resolution using a subnanometre-diameter pore》。

学术背景

研究领域与背景
本研究属于纳米孔测序技术（nanopore sequencing）和蛋白质组学（proteomics）交叉领域。蛋白质的一级结构（primary structure）由其氨基酸序列决定，直接影响蛋白质的折叠与功能。然而，传统蛋白质测序方法（如质谱法（mass spectrometry）和Edman降解法（Edman degradation））存在读长短、灵敏度低等问题，难以满足高通量、高精度测序需求。

纳米孔技术因其单分子检测能力成为潜在解决方案。此前，该技术已成功应用于DNA测序，但由于蛋白质的复杂高级结构（如二级、三级结构）和电荷分布不均，纳米孔在蛋白质测序中的应用受限。本研究旨在通过开发亚纳米级孔径（subnanometre-diameter pore）和蛋白质变性技术，实现对蛋白质一级结构的高分辨率读取。

研究目标
1. 开发一种亚纳米级孔隙，用于检测变性蛋白质分子的氨基酸序列。
2. 验证该技术对氨基酸体积差异的灵敏度，尤其是翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）的检测能力。
3. 探索纳米孔测序在蛋白质组学中的应用潜力。

研究流程与方法

1. 亚纳米孔制备与表征
- 孔隙制造：通过扫描透射电子显微镜（STEM）的电子束溅射技术，在氮化硅（Si₃N₄）薄膜上制备直径小于0.5 nm的孔隙（接近α-螺旋直径）。
- 形貌分析：结合透射电子显微镜（TEM）成像和多层切片模拟（multislice simulations）确认孔隙的双锥形（bi-conical）结构和尺寸。
- 电导测试：通过电解液电导测量和有限元模拟（FES）验证孔隙的亚纳米级尺寸及电场分布。

2. 蛋白质变性处理
- 变性方法：使用十二烷基硫酸钠（SDS）、β-巯基乙醇（BME）和加热（75°C）使蛋白质变性，形成线性化的“棒状”结构，消除高级结构干扰。
- 电荷均一化：SDS赋予蛋白质均匀负电荷，确保电场驱动的 translocation（易位）过程可控。

3. 蛋白质易位与电流阻断检测
- 实验设计：将变性蛋白质溶液置于孔隙的cis侧，施加电场（0.3–1 V）驱动蛋白质通过孔隙，记录电流阻断信号（blockade current）。
- 信号分析：通过电流波动（fluctuations）数量与氨基酸残基数目的对应关系，推断序列信息。

4. 数据分析与模型构建
- 波动计数：采用傅里叶分析和高斯拟合算法统计电流波动次数，验证其与蛋白质氨基酸数量的相关性。
- 体积模型：基于X射线晶体学数据，将氨基酸体积序列转化为阻塞体积模型（occluded volume model），与实验数据对比。
- 翻译后修饰检测：通过对比天然组蛋白H3（H3N）与修饰变体（H3A、H3M）的电流波动差异，评估技术对单残基修饰的灵敏度。

主要结果

1. 孔隙尺寸与电流阻断特性
- 亚纳米孔隙（0.3–0.6 nm）的电流阻断幅度（δi/i₀）与阻塞体积呈正相关，验证了体积检测的可行性。例如，牛血清白蛋白（BSA）的阻断幅度为0.07，而较小蛋白质CCL5在0.5 nm孔隙中阻断幅度升至0.38。

2. 氨基酸序列读取
- 电流波动次数与蛋白质的氨基酸数量一致（如CCL5为68次，BSA为583次），且波动幅度与四聚体（quadromer，4个残基）体积高度相关。
- 通过共识序列（consensus）分析，对CCL5、CXCL1等蛋白质的读取准确率达65–90%，但小体积氨基酸（如甘氨酸）的区分仍受限。

3. 翻译后修饰检测
- 在组蛋白H3的K9位点乙酰化（H3A）和甲基化（H3M）修饰中，技术可检测到体积差异约0.07 nm³（相当于甘氨酸体积），但无法区分所有20种氨基酸。

结论与意义

科学价值
1. 技术突破：首次实现基于亚纳米孔的蛋白质一级结构低通量测序，分辨率达0.07 nm³，可检测单残基修饰。
2. 方法论创新：通过变性处理和电场控制，解决了蛋白质高级结构对纳米孔测序的干扰问题。
3. 应用潜力：为蛋白质组学提供了无需标记、单分子水平的测序新工具，尤其在翻译后修饰研究中有独特优势。

局限性
- 当前技术无法区分所有氨基酸类型，需进一步提高灵敏度和算法精度。
- 依赖高覆盖率（如30×）以提高测序准确性，类似DNA纳米孔测序的策略。

研究亮点

1. 亚纳米孔隙设计：通过STEM制备的孔隙尺寸小于α-螺旋，显著提升化学特异性。
   
2. 体积敏感检测：电流波动直接反映氨基酸体积差异，突破了传统测序技术的限制。
   
3. 变性策略优化：SDS-BME-加热联合处理实现了蛋白质的均一化易位。
   
4. 算法开发：结合傅里叶分析和高斯拟合，实现了低信噪比下的波动计数。
   

其他价值

• 研究为后续开发高精度蛋白质纳米孔测序仪提供了理论基础和技术路线，例如通过优化孔隙几何形状或引入机器学习算法提升分辨率。
  
• 数据与代码公开（GitHub），支持同行复现与改进。
  

（注：原文补充材料提及的有限元模拟细节、蛋白质吸附控制方法等因篇幅限制未展开，可参考原文Supplementary Information。）