人类多能干细胞来源的内皮细胞修复脉络膜缺血的研究报告

作者及机构
本研究由Mengda Li、Peiliang Wang、Si Tong Huo、Hui Qiu等共同完成，主要作者来自北京清华长庚医院眼科中心、清华大学精准医学研究院、清华大学医学院临床医学院等机构。论文发表于《Advanced Science》期刊，2023年发表，DOI: 10.1002/advs.202302940。

学术背景
脉络膜萎缩（choroidal atrophy）是眼底常见的病理改变，与年龄相关性黄斑变性（AMD）、视网膜色素变性（retinitis pigmentosa）和病理性近视（pathological myopia）等疾病密切相关。研究表明，脉络膜内皮细胞（choroidal endothelial cells, CECs）的丢失是脉络膜萎缩的早期事件。目前，针对脉络膜缺血的临床治疗手段有限，尤其是干性AMD等疾病尚无有效疗法。人类多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）可分化为多种眼组织细胞，包括视网膜色素上皮细胞（RPE），但其在脉络膜修复中的应用尚未充分探索。本研究旨在通过hPSCs分化为内皮细胞（endothelial cells, ECs），探索其在脉络膜缺血（choroidal ischemia, CI）动物模型中的治疗潜力。

研究流程
1. hPSCs分化为脉络膜内皮细胞
- 分化方案：采用两阶段化学定义培养系统，第一阶段通过BMP4和CHIR99021诱导hPSCs分化为MESP1+中胚层祖细胞，第二阶段添加VEGF-A和bFGF促进内皮细胞分化。
- 标志物验证：免疫荧光染色显示分化第8天的ECs表达CD31、RGCC（毛细血管标志物）、CA4（脉络膜毛细血管标志物）和PV-1（窗孔结构相关蛋白）。单细胞RNA测序（scRNA-seq）证实分化细胞高表达内皮基因（PECAM1/CD31、CD34、CDH5）。
- 功能验证：通过Dil-ac-LDL摄取实验和体外血管形成实验证实分化ECs具备代谢和成管能力。扫描电镜观察到细胞表面存在100-200 nm的窗孔结构，与天然CECs特征一致。

1. 脉络膜缺血大鼠模型建立

   • 模型构建：通过脉络膜上腔注射氧化剂NaIO₃诱导局部缺血，H&E染色显示脉络膜厚度减少50%，荧光素血管造影（FA/ICGA）显示毛细血管网密度显著降低，模拟了人类干性AMD的病理特征。
     
   • 病理分析：免疫荧光染色显示缺血区域脉络膜毛细血管和中层血管萎缩，但深层血管未受影响。
     

2. hPSC-ECs与缺血脉络膜的体外互作

   • 共培养实验：将hPSC-ECs与离体大鼠缺血脉络膜共培养48小时，scRNA-seq分析显示ECs上调血管生成（VEGFA、HSPG2）、免疫调节（ANXA1、ICAM1）和神经保护（SEMA3F、GRN）相关基因。
     
   • 机制探索：共培养后ECs分泌的HSPG2（基底膜蛋白）和EFNB2（血管形态发生调控因子）可能通过旁分泌作用促进血管修复。
     

3. 体内移植实验

   • 细胞移植：将5×10⁴个hPSC-ECs注射至CI模型大鼠脉络膜上腔，移植后90天内，免疫荧光和流式细胞术证实人源CD31+细胞整合至脉络膜各层血管（毛细血管、中/大血管），形成嵌合血管。
     
   • 功能恢复：FA/ICGA显示移植区域血管密度显著增加，H&E染色证实脉络膜厚度恢复。视网膜电图（ERG）显示移植组暗适应ERG的a波和b波振幅改善，提示光感受器功能部分恢复。
     

主要结果
- 分化效率：hPSC-ECs表达CECs特异性标志物，窗孔结构模拟天然脉络膜毛细血管。
- 模型有效性：NaIO₃诱导的CI模型重现了人类脉络膜萎缩的血管病理特征。
- 治疗效应：移植的hPSC-ECs通过直接整合和旁分泌作用（如分泌VEGFA、SEMA3F）促进血管再生，改善视网膜功能。

结论与价值
本研究首次证明hPSC-ECs可长期（90天）整合至缺血脉络膜，并通过多机制（血管再生、免疫调节、神经保护）修复损伤。其科学价值在于：
1. 机制创新：揭示了hPSC-ECs通过上调SEMA3F（抑制病理性新生血管）和GRN（抗炎）等基因改善微环境。
2. 治疗潜力：为干性AMD、病理性近视等缺乏有效疗法的疾病提供了细胞治疗新策略。
3. 安全性：与间充质干细胞（MSCs）相比，hPSC-ECs未引发炎症反应，移植后无脉络膜新生血管（CNV）等副作用。

研究亮点
- 方法创新：开发了化学定义的无血清分化方案，高效生成CECs样细胞。
- 模型创新：NaIO₃诱导的CI模型更贴近人类疾病病理。
- 多组学验证：结合scRNA-seq、免疫组化和功能实验，全面解析hPSC-ECs的治疗机制。

其他价值
研究局限性包括移植细胞留存率低（需生物材料支架优化）和长期CNV风险未完全排除。未来可探索hPSC-ECs与RPE细胞的联合移植策略，以协同修复视网膜-脉络膜单元。