学术研究报告：OTUB2通过去泛素化RIPK3促进缺血性脑卒中后神经元坏死性凋亡

作者与发表信息

本研究由Fuqi Mei（第一作者）、Xu Wang（通讯作者）等来自Wenzhou Medical University、Oujiang Laboratory、Johannes Gutenberg University Mainz等机构的团队完成，于2025年2月28日发表在EMBO Molecular Medicine（Volume 17, Issue 4）。

学术背景

缺血性脑卒中（Ischemic stroke）是全球致死和致残的主要病因，其核心病理机制是缺血核心区神经元的程序性死亡（Programmed cell death, PCD）。坏死性凋亡（Necroptosis）是一种依赖受体相互作用蛋白激酶3（Receptor-interacting protein kinase 3, RIPK3）和混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）的细胞死亡形式，在脑缺血后早期被激活。然而，RIPK3蛋白丰度的调控机制尚不明确。去泛素化酶（Deubiquitinating enzymes, DUBs）可通过移除底物蛋白的泛素链调控其稳定性，但DUBs是否通过去泛素化RIPK3影响坏死性凋亡未见报道。本研究旨在揭示OTUB2（Otubain-2）通过去泛素化RIPK3调控神经元坏死性凋亡的分子机制，并探索其作为缺血性脑卒中治疗靶点的潜力。

研究流程

1. OTUB2在缺血性脑卒中中的作用验证

• 研究对象：野生型（Otub2+/+）和OTUB2敲除（Otub2−/−）的C57BL/6小鼠，分为假手术组和大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型组（n=5-8/组）。
  
• 实验方法：
  
  • 脑梗死评估：MCAO后24小时，通过TTC染色定量脑梗死体积。
    
  • 神经功能评分：采用改良神经功能缺损评分（mNSS）、转棒试验（Rotarod）和黏附移除试验评估运动功能。
    
  • 血管生理检测：激光多普勒监测脑血流，血压仪测量血压，排除OTUB2对基础生理参数的影响。
    
• 关键结果：OTUB2敲除显著减少脑梗死体积（下降约40%），并改善神经功能缺损（p<0.01）。
  

2. OTUB2对神经元丢失和神经炎症的调控

• 样本处理：MCAO后48小时取脑组织，通过免疫荧光和Western blot分析神经元标志物（NeuN、PSD95）和小胶质细胞激活（Iba1+）。
  
• 结果：
  
  • OTUB2−/−小鼠缺血半暗带神经元存活率显著高于野生型（p<0.05）。
    
  • 小胶质细胞活化和促炎因子（IL-1β、TNF-α）释放减少，但体外实验证实OTUB2不直接调控小胶质细胞炎症反应。
    

3. OTUB2促进RIPK3依赖性坏死性凋亡的机制

• 分子机制验证：
  
  • 体外模型：HT22海马神经元细胞系和原代神经元，通过氧糖剥夺（Oxygen-glucose deprivation, OGD）模拟缺血。
    
  • 关键实验：
    
  • Co-IP与 ubiquitination assay：证实OTUB2与RIPK3直接结合，并特异性移除K48连接的多泛素链（K48-linked polyubiquitin chains）。
    
  • 蛋白酶体抑制实验：MG132处理逆转OTUB2缺失导致的RIPK3降解，证明OTUB2通过抑制蛋白酶体途径稳定RIPK3。
    
  • 酶活性位点突变（C51S）：OTUB2的催化活性依赖C51位点，突变体丧失去泛素化能力。
    
• 数据支持：OTUB2−/−小鼠缺血脑组织中RIPK3蛋白水平下降50%（p<0.01），且RIPK3-MLKL磷酸化信号减弱。
  

4. 药理学抑制OTUB2的 therapeutic 潜力

• 抑制剂处理：
  
  • LN5P45（OTUB2特异性抑制剂）和GSK-872（RIPK3抑制剂）在MCAO前腹腔注射（10 mg/kg）。
    
  • 人脑类器官模型：从H9人胚胎干细胞分化而来，OGD处理后评估神经元死亡。
    
• 结果：LN5P45显著减少小鼠脑梗死体积（p<0.05），并降低类器官中MLKL磷酸化水平。
  

主要结论

1. 机制层面：OTUB2通过其C51位点催化活性去泛素化RIPK3，抑制其蛋白酶体降解，从而增强RIPK3-MLKL信号通路驱动的神经元坏死性凋亡。
   
2. 治疗意义：OTUB2抑制剂（如LN5P45）可减轻缺血性脑损伤，为临床干预提供新靶点。
   

研究亮点

1. 创新性发现：首次揭示OTUB2是RIPK3的上游调控因子，填补了坏死性凋亡中DUBs作用的空白。
   
2. 转化价值：利用人脑类器官验证OTUB2抑制剂的跨物种保护效应，增强临床相关性。
   
3. 方法学优势：结合基因敲除小鼠、原代神经元培养、类器官模型和质谱分析（LC-MS/MS），多维度验证机制。
   

其他价值

本研究还发现OTUB2在衰老小鼠中同样加重脑损伤，提示其在年龄相关卒中中的潜在作用。此外，OTUB2敲除小鼠无明显生理异常，表明靶向OTUB2的治疗可能具有较低副作用。

（全文共计约1800字）