本文的研究由Paul E. Bourginea（第一作者）、Thibaut Kleinb（共同第一作者）、Ivan Martinb和Timm Schroedera（共同通讯作者）领导，合作团队来自瑞士巴塞尔的多个研究机构：苏黎世联邦理工学院（ETH Zürich）生物系统科学与工程系，以及巴塞尔大学医院生物医学系的组织工程、干细胞与造血、实验血液学等实验室。这项研究成果发表于2018年6月4日的《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, PNAS）。
这项研究的学术背景聚焦于造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell, HSC）与骨髓微环境（Bone Marrow Niche） 这一生命科学前沿领域。在成人体内，造血干细胞和祖细胞（Hematopoietic Stem and Progenitor Cells, HSPCs）驻留在骨髓微环境中，其自我更新和分化受到来自基质细胞、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）、细胞因子以及物理结构等多种复杂信号的综合调控。然而，由于难以获取人类骨髓样本以及现有体外培养模型的局限性，我们对人类造血过程及其生态位生物学的理解仍很有限。例如，动物嵌合模型虽然能模拟体内生理环境，但存在着种间差异、难以进行实验操控和实时观察等缺点。因此，开发一个体外、可调控、且能模拟人类骨髓复杂结构与功能的三维（3D）培养系统，对于深入研究人类造血干细胞的生物学特性、其与生态位的相互作用、以及血液疾病的发病机理至关重要。本研究的主要目标正是为了建立一个能够模拟人类骨髓造血生态位关键特征的3D工程化组织，从而提供一个用于研究人类造血过程的实验平台。
研究的详细工作流程可以概括为以下几个主要步骤：
1. 基质组织的构建与功能化： 这是整个实验的基础。研究人员首先使用具有骨组织类似结构和成分的多孔羟基磷灰石（Hydroxyapatite）陶瓷作为三维支架。他们将源自人类骨髓的间充质基质细胞（Human Mesenchymal Stromal Cells, hMSCs）接种到支架上，并将其置于一个灌注式生物反应器（Perfusion Bioreactor） 系统中进行培养。这个生物反应器系统是本实验的一个关键设备，它通过持续的灌流为深部的细胞输送营养并带走废物，同时模拟了体内骨髓中的间质液流和相关的剪切应力，这对于细胞的功能和组织的形成至关重要。培养过程分为两个阶段：首先在增殖培养基（Proliferative Medium, PM）中培养一周，以促进细胞增殖并确保其在支架内的充分定植；随后转为成骨诱导培养基（Osteogenic Medium, OM）中培养三周，以诱导hMSCs向成骨细胞谱系分化，并刺激其分泌和沉积大量的细胞外基质。经过四周的培养，最终形成了富含细胞和ECM的“工程化生态位（Engineered Niche, EN）”。作为对照，未接种hMSCs的“裸”陶瓷支架（Ceramic only, CE）也被并行制备。
2. 造血干/祖细胞的引入与共培养： 在构建好工程化基质组织后，研究人员从脐带血（Cord Blood）中纯化出人类CD34+造血干/祖细胞（HSPCs），将其灌注到生物反应器的管路中，使其进入并定居于已构建好的EN或CE支架内部。随后，整个体系在生物反应器中继续进行为期一周的共培养。培养使用的是成分明确的血清替代培养基，其中仅补充了低剂量的三种关键造血细胞因子：血小板生成素（TPO）、干细胞因子（SCF）和Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3-l），以创造一个相对“朴素”且可控的微环境，更利于观察生态位本身的支持作用。
3. 系统性分析与功能验证： 一周共培养结束后，研究人员从生物反应器中取出组织，进行了全面而多层次的分析： * 细胞表型与数量分析： 使用胶原酶和胰蛋白酶消化组织，回收所有细胞，通过流式细胞术精确量化各种造血细胞群的数量，包括原始的造血干细胞（HSC）、多能祖细胞（Multipotent Progenitor, MPP）、多能淋巴祖细胞（Multilymphoid Progenitor, MLP）以及更分化的祖细胞和成熟细胞。结果显示，与CE对照组相比，EN条件显著促进了总血细胞数（增加了61倍 vs 7.8倍）以及所有HSPC亚群（HSC、MPP、MLP）数量的扩增。 * 体外功能验证： 将回收的CD34+细胞进行集落形成单位（Colony-Forming Unit, CFU）实验，检测其增殖和多向分化潜能。结果表明，来自EN的细胞产生的髓系集落（如CFU-GM, BFU-E, CFU-GEMM）数量远超CE对照组，证明EN中培养的细胞保持了更强的祖细胞功能。 * 体内功能验证： 这是检验HSC功能的金标准之一。研究人员将等数量的、来自不同培养条件的CD34+细胞通过股骨内注射移植到经辐射清髓的免疫缺陷小鼠（NSG小鼠）体内。长期（长达28周）监测小鼠外周血、骨髓和脾脏中人造血细胞（hCD45+）的嵌合水平以及髓系、淋巴系的再殖情况。结果显示，来自EN和CE的细胞均能成功长期植入并实现多系造血重建，而EN组的嵌合水平有高于CE组的趋势。这证明EN培养体系不仅扩增了表型上的HSPC，更维持了具有体内长期再殖能力的干细胞功能。 * 工程化生态位的分子与结构表征： 研究人员对EN组织本身进行了深入分析。通过免疫荧光和共聚焦显微镜观察，证实EN内形成了由hMSCs构成的均质网络，并沉积了胶原蛋白I型、IV型和纤连蛋白等骨髓中关键的ECM成分，其结构与成分与真实人骨髓活检样本相似。此外，通过Luminex多因子检测和基因表达分析，发现EN中高表达IL-6、IL-8、M-CSF等促炎因子，且hMSCs在与HSPCs共培养后，其基因表达谱呈现出成骨细胞样（高表达碱性磷酸酶ALP、骨桥蛋白BSP）和生态位相关（如Nestin表达上调）的特征，表明一个相互作用的、具有成骨生态位特征的微环境已经形成。 * 功能性区室化分析： 本研究的一个重要观察是，生物反应器系统内存在自然的“区室化（Compartmentalization）”。系统分为固态的“组织/ECM”相和液态的“上清液（Supernatant, SN）”相。流式分析发现，最原始的HSC几乎全部（98%）驻留在ECM相中，而随着细胞向更成熟的分化状态过渡（如粒细胞-full噬细胞祖细胞GMP），其在SN相中的比例逐渐增加。这模拟了体内干细胞倾向于锚定在基质生态位中，而分化细胞则更易进入循环的现象。进一步分析显示，从ECM相回收的CD34+细胞比从SN相回收的具有更强的体外集落形成能力。 * 微环境定制与扰动实验（概念验证）： 为展示该平台的可调控性，研究人员进行了两项概念验证实验。其一，分子定制：通过慢病毒转导，使hMSCs过表达SDF-1α（基质细胞衍生因子-1α，一种重要的HSC趋化因子），构建了SDF-1α强化的EN。结果发现，过表达SDF-1α并未增加HSC数量，反而通过细胞周期分析证实，它促使更多驻留在ECM中的HSC和MPP进入了静止（G0期）状态，展示了通过遗传修饰生态位细胞来精细调控干细胞行为的能力。其二，模拟损伤：在引入HSPCs前，用博来霉素（Bleomycin，一种引起DNA损伤的药物）处理EN，模拟生态位损伤。结果显示，“损伤”后的EN中HSC数量增加，但处于静止期的HSC比例下降，表明损伤扰乱了生态位维持HSC静止状态的能力，可能驱动了HSC的增殖反应。这为研究病理条件下（如化疗后或白血病前期）的生态位-干细胞相互作用提供了模型。
本研究的主要结果相互关联，层层递进：首先，成功构建了结构与成分类似人骨髓的3D工程化组织（EN）；其次，该EN在低因子条件下能有效支持HSPCs的维持与扩增，并保持其体内外功能；再者，发现并证实了系统内自然的区室化现象，这反映了生态位的空间调控功能；最后，通过分子定制和损伤模拟，证明了该平台具有高度可调性和用于模拟特定生理/病理场景的潜力。所有这些结果共同指向一个核心结论：本研究建立了一个功能复杂、可调控的人类骨髓体外三维模拟系统，它不仅部分重现了骨髓生态位的结构、成分和组织特征，更重要的是支持了功能性造血干/祖细胞的维持。
该研究的科学价值与应用意义十分显著。在科学价值方面，它提供了一个全新的、完全人源化的实验平台，克服了传统动物模型和二维培养的诸多局限，使研究人员能够在可控条件下，实时观察和操纵人类造血干细胞与其微环境之间的相互作用，从而更深入地解析人类造血生态位的生物学原理。在应用价值方面，该平台具有广阔的前景：1）基础研究工具：用于发现调控HSC命运（如自我更新、分化、归巢、静止）的新因子和机制；2）疾病建模：未来可整合来自白血病等血液疾病患者的hMSCs和/或HSPCs，构建个体化的疾病模型，用于研究发病机理；3）药物筛选与治疗测试：为筛选影响造血或靶向白血病干细胞/生态位的药物提供高通量、更贴近生理的测试系统；4）细胞治疗支持：作为优化HSC体外扩增和功能维持培养体系的测试平台，对基于HSC的再生医学具有潜在推动作用。
本研究的亮点在于：第一，高度的生物复杂性：成功整合了三维支架、多种人源原代细胞（hMSCs, HSPCs）、细胞自分泌的ECM以及模拟体内流体动力学的灌注培养，构建了一个具有“器官样”特征的工程化组织。第二，功能验证全面：不仅进行了详尽的表型分析，还通过体内移植实验这一金标准证明了所维持的HSC具有长期多系再殖功能，这是许多现有体外模型难以企及的。第三，发现了功能性区室化：这一自发现象使该系统能够模拟干细胞在生态位中“锚定”与“释放”的动态过程，为研究细胞迁移和空间定位提供了独特视角。第四，强大的可调性和模块化：通过遗传工程改造生态位细胞（如过表达SDF-1α）或施加外部扰动（如药物损伤），证明了平台可根据研究需求进行定制，用于探索特定分子或病理状态下的生态位功能。这些特点共同使得该研究超越了以往简单的2D共培养或基于合成材料的3D模型，代表了组织工程和干细胞生物学交叉领域的一项重要进展。