主要作者与机构
本研究由京都大学医学生命科学研究所的超微结构病毒学实验室主导完成，第一作者为张子涵（Zihan Zhang），通讯作者为野田岳志（Takeshi Noda）。参与研究的机构还包括德国马尔堡菲利普斯大学病毒学研究所、北海道大学人兽共患病控制国际研究所、筑波大学医学医疗系等。该研究于2024年5月29日在线发表在 Journal of Virology 期刊上，卷期号为第98卷第7期，文献编号为10.1128/jvi.00714-24。
研究背景
拉沙病毒（Lassa virus, LASV）是拉沙热（Lassa fever）的病原体，最早于1969年在尼日利亚拉沙村的一所医院中被分离鉴定。该病毒属于沙粒病毒科（*Arenaviridae*）哺乳动物沙粒病毒属（*Mammarenavirus*），是一种具有双节段单链双义RNA基因组的包膜病毒。据估计，拉沙病毒每年在西非地区引起约30万例感染和5000例死亡，住院患者的病死率可高达20%。拉沙病毒与胡宁病毒（Junín virus, JUNV）、萨比亚病毒（Sabiá virus, SABV）、瓜纳里托病毒（Guanarito virus, GTOV）和马丘波病毒（Machupo virus, MACV）等一同被列为A类优先病原体（category A priority pathogens）。然而，目前尚无获批的疫苗或特异性抗病毒药物可用于拉沙热的预防和治疗。
拉沙病毒糖蛋白复合物（glycoprotein complex, GPC）在病毒入侵宿主细胞过程中发挥关键作用。GPC在内质网和高尔基体中被信号肽酶和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin同工酶-1/位点1蛋白酶（proprotein-convertase subtilisin kexin isozyme-1/site 1 protease）切割，产生由稳定信号肽（stable signal peptide, SSP）、GP1亚基和GP2亚基组成的三聚体复合物。病毒入侵时，GP1首先与主要受体α-肌营养不良聚糖（α-dystroglycan, α-DG）结合，随后病毒颗粒通过巨胞饮作用（macropinocytosis）被内吞进入细胞内囊泡。在晚期内体的酸性环境中，GP1与α-DG解离并与胞内受体溶酶体相关膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein 1, LAMP1）结合，随后GP1从GP2上解离，GP2发生构象变化诱导病毒包膜与宿主细胞膜融合，从而将病毒基因组释放到细胞质中。
本研究团队此前曾利用重组水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）表达拉沙病毒糖蛋白（VSV-LASVGP）筛选约2500种小分子化合物，鉴定出P-糖蛋白抑制剂CP100356盐酸盐作为潜在的泛沙粒病毒入侵抑制剂。在此基础上，本研究重新筛选该化合物库，旨在寻找特异性抑制拉沙病毒入侵的候选药物。
研究流程与实验方法
本研究的工作流程可分为化合物筛选与验证、抗病毒活性评价、作用机制解析、耐药突变体分析以及分子模拟等多个环节。
第一环节：化合物筛选与抗病毒活性验证。 研究团队利用表达拉沙病毒糖蛋白的复制型重组水疱性口炎病毒（VSV-LASVGP）对2480种药理活性小分子化合物进行了重新筛选。筛选标准为：在10 µM浓度下使VSV-LASVGP复制降低10倍以上，且细胞存活率高于阳性对照药物拉西地平（lacidipine）。经过排除直接抑制VSV复制的化合物后，选中了人工合成的非甾体雌激素受体激动剂己烷雌酚（hexestrol, HES）进行深入分析。
在抗病毒活性评价中，Vero细胞预先用不同浓度的HES处理1小时，随后以0.01的感染复数（multiplicity of infection, MOI）感染VSV-LASVGP，24小时后通过空斑试验测定病毒滴度。结果显示HES以剂量依赖性方式抑制VSV-LASVGP复制，半数抑制浓度（50% inhibitory concentration, IC₅₀）为0.63 µM，半数细胞毒性浓度（50% cytotoxic concentration, CC₅₀）为49.6 µM，选择性指数（selective index, SI）为78.7。在生物安全4级（biosafety level 4, BSL-4）条件下，对真实拉沙病毒（Josiah株）的抑制试验表明HES在感染后第1天和第2天的IC₅₀分别为0.31 µM和0.61 µM。相比之下，HES对淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV）和VSV几乎无抑制作用，IC₅₀值比拉沙病毒高17倍以上。利用携带不同沙粒病毒糖蛋白的假型VSV进行的实验进一步表明，HES能显著抑制拉沙病毒Josiah株和Togo株糖蛋白介导的入侵，以及萨比亚病毒（SABV）和Tacaribe病毒（TCRV）糖蛋白介导的入侵，但对LCMV、JUNV和MACV糖蛋白介导的入侵无抑制作用。在人肺来源的A549细胞中也获得了类似结果。
第二环节：作用机制解析。 为确定HES作用于病毒入侵的哪个阶段，研究团队进行了加药时间点实验（time-of-addition assay）。结果显示，当HES仅存在于预感染和吸附阶段时几乎无抑制作用，而当HES存在于感染后阶段时表现出与全程存在相当的强抑制效果，表明HES阻断的是受体结合之后的入侵步骤。随后进行了基于细胞的膜融合实验：HEK293T细胞共转染病毒糖蛋白表达质粒和GFP表达质粒，24小时后（VSV-G为12小时）用10 µM HES或1 µM ST-193（已知的膜融合抑制剂）处理，再用低pH缓冲液（pH 4.5）触发膜融合。结果显示HES和ST-193均能抑制LASVGP诱导的合胞体形成，但不能抑制LCMVGP或VSV-G诱导的膜融合，证明HES特异性抑制拉沙病毒糖蛋白介导的膜融合过程。
第三环节：靶点确证与耐药突变体分析。 为验证雌激素受体是否参与HES的抗病毒活性，研究者使用了亚型选择性雌激素受体激动剂PPT（α型选择性）和erteberel（β型选择性）。结果显示这些化合物在无细胞毒性的浓度下均不能抑制假型VSV-LASVGP的入侵，提示雌激素受体本身不太可能参与HES的抗病毒作用。为获取HES耐药突变体，研究者在16.7 µM HES存在下将VSV-LASVGP连续传代5轮，序列分析发现拉沙病毒糖蛋白基因第1336位核苷酸发生T到C的单点突变，导致GP2亚基第446位氨基酸由苯丙氨酸（phenylalanine, F）变为亮氨酸（leucine, L）。F446位于GP2的跨膜结构域（transmembrane domain），在拉沙病毒糖蛋白三聚体结构（PDB: 7PUY）中位于相邻单体的稳定信号肽附近。序列比对显示F446在哺乳动物沙粒病毒中高度保守。假型病毒实验证实F446L突变体对HES完全不敏感，即使10 µM浓度也无法抑制其感染；膜融合实验同样证明HES不能抑制F446L突变体诱导的膜融合。复制动力学实验显示VSV-LASVGP(F446L)的病毒滴度在各时间点均显著低于野生型，表明F446对病毒高效生长至关重要。不同pH条件下的膜融合实验显示，F446L突变体在pH 5.0和pH 5.5的较高pH条件下即可诱导膜融合，而野生型仅在pH 4.5时才能诱导融合，提示F446L突变降低了糖蛋白预融合状态的稳定性，可能导致过早触发膜融合，从而降低了病毒复制能力。
第四环节：分子模拟与结合位点预测。 由于F446所在的胞质域结构尚未被解析，研究团队利用AlphaFold2在ColabFold服务器上构建了完整的SSP-GP2复合物结构模型，并与冷冻电镜结构（PDB: 7PUY）进行叠加，使用SiteMap软件在跨膜区识别出一个潜在的配体结合位点。分子对接和分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟显示，HES嵌入由三条GP2 α-螺旋和三条SSP α-螺旋组成的跨膜区三聚体内部口袋中。MD模拟的均方根偏差（root mean square deviation, RMSD）在150 ns内达到平衡，表明结合稳定。模拟结果显示T438和Y441分别与HES形成氢键和π-π堆积相互作用，F434通过疏水相互作用参与HES结合。F446的侧链并不伸入该结合位点，提示F446可能不直接与HES相互作用，而是通过影响局部螺旋间相互作用来调控药物进入或结合口袋的能力。为验证这些氨基酸残基的作用，研究者构建了F434A、T438A和Y441A单点突变体。其中T438A突变体表达量大幅降低，F434A和Y441A假型病毒的滴度较野生型低100倍以上。HES对F434A和Y441A突变体的抑制作用明显减弱，进一步支持F434和Y441参与HES结合的结论。
主要结论与研究意义
本研究首次证明了雌激素受体激动剂己烷雌酚是一种有前景的抗拉沙病毒候选药物，其通过直接结合拉沙病毒糖蛋白的跨膜结构域来阻断膜融合步骤，从而抑制病毒入侵。雌激素受体本身不参与该抗病毒活性。耐药突变分析揭示GP2跨膜区的苯丙氨酸446残基在HES的抗病毒活性中发挥关键作用，该残基的突变虽然增强了糖蛋白的膜融合活性，但降低了预融合状态的稳定性，导致病毒复制能力显著下降。
本研究的意义体现在以下方面：在科学层面，研究揭示了拉沙病毒糖蛋白跨膜区作为抗病毒药物靶点的重要性，特别是F446残基及其与SSP的相互作用对糖蛋白结构稳定性和膜融合调控的关键功能，为深入理解沙粒病毒糖蛋白的构象调控机制提供了新见解。在应用层面，HES作为一种已在临床上用于雌激素替代疗法的已知药物，具有良好的安全性基础，其作为抗拉沙病毒候选药物的开发前景值得期待。此外，研究发现的跨膜区结合口袋和关键氨基酸残基信息，为基于结构的抗拉沙病毒药物设计提供了重要参考。
研究亮点
本研究的亮点在于：第一，从药物重定位（drug repurposing）的角度出发，发现了一种已上市药物HES具有高效的抗拉沙病毒活性，且选择性指数达到78.7，具有良好的成药潜力。第二，通过耐药突变体的分离和鉴定，精准定位了GP2跨膜区F446残基在HES抗病毒活性中的核心作用，并将其与糖蛋白预融合状态的稳定性调控联系起来，阐明了耐药性的结构基础。第三，综合运用冷冻电镜结构建模、AlphaFold2结构预测、分子对接和分子动力学模拟等多种计算手段，构建了完整的拉沙病毒糖蛋白结构模型，预测了HES在跨膜区三聚体内部口袋中的结合模式，并通过点突变实验进行了验证，形成了从计算预测到实验确证的完整研究范式。第四，研究发现HES对萨比亚病毒和Tacaribe病毒也具有抑制活性，但对LCMV、JUNV和MACV无效，通过序列比对分析提示SSP第32位氨基酸的差异可能与药物特异性相关，为理解沙粒病毒糖蛋白跨膜区的结构-功能关系提供了新线索。