本研究由北京中医药大学东直门医院肾病内分泌科的周少峰、郑慧娟、张兴华等学者共同完成，通讯作者为孙卫卫和王耀献。该论文发表于 Chinese Medicine 期刊（2026年第21卷，文章编号113），于2026年4月7日正式出版。研究得到了国家自然科学基金联合基金区域创新发展项目的资助（批准号：U22A203373）。
糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病主要的微血管并发症之一，也是全球终末期肾病的主要原因。约有三分之一的糖尿病患者在疾病进展过程中会发展为DKD。目前的治疗策略主要依赖于血糖和血压控制、肾素-血管紧张素系统靶向药物，以及钠-葡萄糖协同转运蛋白2（sodium-glucose cotransporter-2，SGLT2）抑制剂和胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受体激动剂等新型疗法。然而，这些干预手段虽能延缓疾病进展，却极少能逆转已建立的肾损伤，许多患者仍持续出现蛋白尿和肾功能进行性丧失。
足细胞（podocyte）是终末分化的上皮细胞，负责维持肾小球滤过屏障的结构和功能稳定性。在糖尿病环境中，代谢失衡、氧化损伤和晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）的积累等多种致病因素促进足细胞损伤，导致足突融合、脱落以及nephrin和podocin等结构蛋白表达下降，最终造成滤过屏障破坏和蛋白尿产生。近年来，铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖性的调节性细胞死亡方式，被证实参与DKD条件下足细胞的损伤过程。铁死亡的核心调控机制涉及system Xc⁻/GSH/GPX4轴，其中核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）作为关键的转录调节因子，可上调SLC7A11和GPX4的表达并抑制铁死亡。
止消散正汤（Zhixiaosanzheng Formula，ZXSZF）是一种基于“肾络癥瘕”理论研发的经验方，在DKD治疗中已显示出一定的临床疗效，但其分子机制尚不明确。因此，本研究旨在通过网络药理学预测和体内外实验验证，探讨ZXSZF是否通过调节铁死亡相关通路保护足细胞。
研究首先采用液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）对ZXSZF的化学成分进行鉴定，共鉴定出94种化学成分。随后，通过SwissADME平台筛选具有高胃肠道吸收率和生物利用度评分≥0.5的化合物，最终保留48种代谢物。利用SwissTargetPrediction数据库对这些代谢物进行靶点预测，以概率>0.5为标准筛选出449个靶点。DKD相关靶点从GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库收集，去重后获得1182个靶点；铁死亡相关靶点从FerrDB数据库检索获得484个靶点。通过韦恩图（Venn diagram）分析，三者的交集包含28个重叠靶点，被定义为“潜在相关靶点”。将这28个靶点导入STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，生成了包含28个节点和402条边的网络。关键节点包括NFE2L2（Nrf2）、JUN和STAT3。随后使用DAVID数据库进行功能富集分析，基因本体（Gene Ontology，GO）分析阈值为p<0.05且FDR<0.05，WikiPathways分析阈值为p<0.01。GO富集结果显示这些靶点主要与氧化应激反应和脂质代谢调控相关的生物学过程有关，WikiPathways富集分析进一步提示Nrf2信号通路的显著富集。
ZXSZF由七味中药组成：石仙桃（Pholidota chinensis Lindl，50g）、黄芪（Astragalus mongholicus Bunge，30g）、黄蜀葵花（Abelmoschus manihot (L.) Medik.，30g）、牛蒡子（Arctium lappa L.，9g）、杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.，10g）、海藻（Sargassum pallidum (Turn.) C. Ag，30g）和水蛭（Hirudo nipponica Whitman，6g）。药材经文火煎煮两次，合并滤液后浓缩至生药浓度1g/ml。大鼠剂量根据体表面积换算原理确定：低剂量组（ZXSZF-L）为14.85g/kg，高剂量组（ZXSZF-H）为29.7g/kg。细胞实验所用ZXSZF冻干粉经-80℃真空冷冻干燥获得。
实验动物为5-7周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠。DKD模型通过单侧肾切除联合链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，55mg/kg腹腔注射）诱导。注射STZ三天后空腹血糖>16.7mmol/L的大鼠被定义为糖尿病大鼠并纳入研究。大鼠随机分为六组（每组n=10）：对照组、模型组、ZXSZF低剂量组、ZXSZF高剂量组、缬沙坦组（valsartan，8mg/kg，阳性对照）和铁死亡抑制剂Ferrostatin-1组（Fer-1，2.5mg/kg）。ZXSZF和缬沙坦每日灌胃一次，持续12周；Fer-1腹腔注射给药。实验期间每周记录体重和血糖。实验结束时收集尿液和血液样本进行生化分析，取肾组织进行组织学检查和分子生物学检测。尿微量白蛋白/肌酐比值（urinary albumin-to-creatinine ratio，UACR）在第4、8、12周进行评估。肾组织病理学采用苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin，H&E）、马松三色染色（Masson’s trichrome）和过碘酸-雪夫染色（periodic acid-Schiff，PAS）评价，超微结构通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察。肾组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、亚铁离子（Fe²⁺）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量使用商业试剂盒测定。蛋白质表达水平通过蛋白免疫印迹法（Western blot）检测。
体外实验采用条件永生性小鼠足细胞系MPC5。细胞在含IFN-γ的RPMI-1640培养基中于33℃培养增殖，随后转入37℃无IFN-γ的条件下培养10-14天以诱导分化。分化后的MPC5细胞以AGE-BSA（200μg/ml）处理24小时以模拟DKD中的足细胞损伤，以非糖化的Co-BSA作为对照。ZXSZF浓度筛选通过CCK-8检测完成，最终确定100μg/ml为最佳作用浓度。细胞活力和细胞毒性分别通过CCK-8和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放实验检测。细胞骨架通过鬼笔环肽（phalloidin）染色观察。细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）使用DCFH-DA荧光探针检测。MDA和Fe²⁺水平使用商业试剂盒测定。nephrin、podocin、Nrf2、SLC7A11和GPX4的蛋白表达通过Western blot和免疫荧光（immunofluorescence）检测。为验证Nrf2通路的作用，使用Nrf2抑制剂ML385（5μM）进行干预实验。
LC-MS/MS分析共鉴定出ZXSZF中94种化学成分，筛选后保留48种具有良好药代动力学特性的活性代谢物，包括金丝桃苷（hyperoside）、牛蒡子苷元（arctigenin）、异槲皮苷（isoquercitrin）和毛蕊异黄酮（calycosin）等。这些代谢物预测靶点与DKD和铁死亡相关靶点的交集包含28个基因，PPI网络分析显示Nrf2（NFE2L2）为关键节点分子。功能富集分析表明这些靶点主要富集于Nrf2信号通路和氧化应激反应相关的生物学过程。
与模型组相比，ZXSZF低剂量组、高剂量组和缬沙坦组在12周治疗后血糖水平均有不同程度的降低。模型组大鼠体重在研究期间持续下降，而ZXSZF治疗组在第8周和第12周时体重有显著改善。模型组的肾脏指数（肾脏重量/体重×100%）显著高于对照组（p<0.0001），ZXSZF低剂量、高剂量和缬沙坦治疗均显著减轻了这一增加（均p<0.05）。肾功能方面，模型组UACR从第4周即显著升高并持续至第12周，ZXSZF和缬沙坦治疗在干预期间均显著降低了UACR水平。模型组血清肌酐和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）显著升高，ZXSZF或缬沙坦治疗均显著降低了两项指标，且ZXSZF治疗组与缬沙坦组间无显著差异。
组织学检查显示，模型组肾小球明显增大并伴有萎缩和硬化，马松染色显示大量胶原沉积和纤维化改变，PAS染色显示系膜基质扩张、细胞外基质沉积和Kimmelstiel-Wilson结节形成。ZXSZF低剂量、高剂量和缬沙坦治疗均明显减轻了上述病理改变。TEM观察显示模型组肾小球基底膜增厚、足细胞足突融合和足细胞数量减少，ZXSZF和缬沙坦治疗均减轻了这些超微结构异常。
与对照组相比，模型组肾组织中nephrin表达降低而desmin表达升高（均p<0.05）。ZXSZF各组和缬沙坦治疗均部分逆转了这些变化（均p<0.05），Fer-1组也呈现相似的保护效应。铁死亡相关生化指标显示，模型组肾组织MDA（p<0.05）和Fe²⁺（p<0.01）水平显著升高而GSH含量降低（p<0.01）。ZXSZF和Fer-1治疗均逆转了这些改变。Western blot结果显示，模型组Nrf2（p<0.01）和GPX4（p<0.05）表达显著降低，ACSL4表达升高（p<0.05），SLC7A11有降低趋势但未达统计学显著性。ZXSZF各剂量组和Fer-1组均升高了Nrf2、SLC7A11和GPX4的表达，同时降低ACSL4水平。
体外实验中，AGEs暴露显著降低了足细胞活力（p<0.01）并增加LDH释放。ZXSZF（100μg/ml）处理显著改善了细胞活力并降低LDH释放。鬼笔环肽染色显示AGEs暴露破坏了肌动蛋白细胞骨架组织，ZXSZF或Fer-1处理减轻了这些结构改变。Western blot结果显示AGE-BSA暴露导致nephrin和podocin表达显著降低（均p<0.05），ZXSZF处理升高了nephrin（p<0.05）和podocin（p<0.01）的表达。
在AGEs刺激的MPC5细胞中，ZXSZF处理显著降低了MDA、Fe²⁺和ROS水平，同时升高了Nrf2、SLC7A11和GPX4的蛋白表达（均p<0.05）。免疫荧光染色显示了相似的表达分布模式。ML385干预实验中，AGEs+ML385组的Nrf2蛋白水平显著低于对照组（p<0.05），ZXSZF处理相对于AGEs+ML385组升高了Nrf2表达（p<0.05）。SLC7A11和GPX4也呈现一致的变化趋势，ZXSZF处理相对于AGEs+ML385组升高了两者的表达（均p<0.05）。
本研究首次整合LC-MS/MS化学表征、网络药理学预测和体内外实验验证，系统阐明了ZXSZF通过调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡、保护足细胞、改善DKD肾损伤的作用机制。该研究为ZXSZF治疗DKD的机制基础提供了实验证据，支持其作为DKD管理中的潜在补充治疗选择。
本研究的科学价值在于：第一，不同于以往主要关注单一活性化合物的研究，本研究聚焦于多组分中药复方，为复杂中药方剂的机制研究提供了范式；第二，研究将化学分析、计算预测和实验验证相结合，构建了“成分-靶点-通路”的系统研究框架；第三，研究特别强调足细胞铁死亡这一DKD进展中的关键事件，而非仅关注肾小管损伤。在应用价值方面，本研究为ZXSZF的临床应用提供了科学依据，也为DKD的治疗策略开发提供了新的靶点和思路。
需要指出的是，本研究采用的单侧肾切除联合STZ诱导模型虽能复制DKD的主要病理特征，但无法完全模拟人类DKD的慢性和多因素进程。未来需要在db/db小鼠、KK-Ay小鼠等不同模型中进一步验证。同时，网络药理学的预测靶点尚未经过实验确证，存在假阳性的可能。未来可应用热蛋白质组分析（thermal proteome profiling，TPP）等高通量靶点鉴定技术识别ZXSZF的直接分子靶点，以进一步明确其作用机制。