本文属于类型a，即单项原创研究的学术报告。

该研究由Roche Diagnostics GmbH的Judith Taibon、Kerstin Kandler、Michael Stadlmeier、Neeraj Singh、Andrea Geistanger、Christian Geletneky以及Chrestos Concept GmbH & Co. KG的Friederike Bauland共同完成，发表于Clin Chem Lab Med期刊2026年第64卷第1期，在线发表时间为2025年3月6日。

在学术背景方面，维生素D（vitamin D）是一组具有多系统重要性的脂溶性分子，尤其在肌肉骨骼系统中发挥关键作用。维生素D的主要形式麦角钙化醇（ergocalciferol，D2）和胆钙化醇（cholecalciferol，D3）在体内经过多种细胞色素P450酶（CYP酶）介导的羟化反应代谢。循环中的主要形式25-羟基维生素D（25-hydroxyvitamin D，25[OH]D）进一步转化为活性代谢物1,25-二羟基维生素D（1,25-dihydroxyvitamin D，1,25[OH]2D）。而25(OH)D和1,25(OH)2D均可在CYP24A1酶的作用下于24位发生羟化，分别生成非活性代谢物24,25-二羟基维生素D（24,25-dihydroxyvitamin D，24,25[OH]2D）和1,24,25-三羟基维生素D（1,24,25-trihydroxyvitamin D），随后排出体外。24,25(OH)2D作为CYP24A1催化的主要分解代谢产物，其检测对于识别因CYP24A1基因突变导致的高钙血症和复发性肾结石具有重要价值，尤其在补充维生素D的患者中。临床上通常通过计算25(OH)D与24,25(OH)2D的维生素D代谢物比值（vitamin D metabolite ratio，VMR）来辅助诊断，VMR还被提议作为维生素D充足性的另一指标。然而，不同实验室间方法学的异质性导致检测结果的精密度和准确度存在较大差异。尽管国际检验医学溯源性联合委员会（Joint Committee on Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）列出了若干用于测量血清25(OH)D的高等级参考测量程序（reference measurement procedure，RMP），但针对24®,25-二羟基维生素D3（24,25[OH]2D3）仅有一个列出的RMP，而针对24®,25-二羟基维生素D2（24,25[OH]2D2）则完全没有。因此，该研究旨在建立人血清和血浆中24,25(OH)2D2和24,25(OH)2D3的候选参考测量程序，以满足ISO 15193对参考测量程序的要求。

在工作流程方面，研究首先利用定量核磁共振（quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR）波谱技术对24,25(OH)2D2和24,25(OH)2D3的参考物质进行绝对含量赋值，从而确保SI单位可追溯性。以氘代氯仿为溶剂、tecnazene为qNMR内标，利用烯烃质子的单脉冲1H{13C}NMR谱进行定量。结果显示24,25(OH)2D2的绝对含量为91.1±0.5%，24,25(OH)2D3为97.1±0.2%。此外，还进行了量子化学计算以确定两种分析物在溶液中的构象分布以及最容易发生氢原子转移的化学键。在配制校准品与质控品时，分别称取约1 mg分析物溶解于1 mL乙醇中制备三种独立称量的储备液，并根据qNMR纯度计算精确浓度。储备液进一步稀释为工作溶液，再稀释成添加溶液，最后以1+49的比例加入维生素D耗竭人血清基质中，得到0.150–18.0 ng/mL范围的八个校准水平。质控样本以类似方式制备，并利用了NIST SRM 2971校准溶液和NIST SRM 2973次级参考物质。样本前处理采用固相支持液液萃取（supported liquid extraction，SLE）方案，将400 µL样本与40 µL内标工作液混合，孵育后加入碳酸盐缓冲液释放蛋白，上样至SLE柱并用乙酸乙酯洗脱，氮气吹干后以甲醇/水复溶，过滤后进样。液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析使用Thermo Fisher TSQ Altis三重四极杆质谱仪，结合二维中心切割液相色谱系统，第一维采用Hypersil Gold C4柱，第二维采用Kinetex F5柱，通过正交固定相组合减少基质效应和同量异位素干扰。检测采用正电喷雾电离模式下的多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM），定量离子对为24,25(OH)2D2的m/z 393.3→268.3和24,25(OH)2D3的m/z 417.3→381.3，并监测定性离子对以识别未知干扰。系统适用性测试要求信噪比、保留时间和差向异构体分离度达到规定标准。方法验证包括选择性/特异性、基质效应、精密度、正确度、准确度、线性、测量区间下限和样本稳定性评估。选择性通过在人血清中加入内标及结构类似物如3-epi-24,25(OH)2D2、3-epi-24,25(OH)2D3、1(α),25(OH)2D2、1(α),25(OH)2D3、25,26(OH)2D3和23(S),25(OH)2D3来评价。基质效应采用柱后灌注实验和标准线斜率比较进行评估。精密度通过为期五天的验证实验，利用NIST SRM 972a认证次级参考物质和加标血清样本，每个样本每天制备三份、每份进样两次，共60次测量，采用方差分析确定总变异性。测量不确定度依据《测量不确定度表示指南》（Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，GUM）计算，综合校准品制备的B类不确定度和精密度实验的A类不确定度，乘以包含因子k=2。为证明与JCTLM列出的RMP等效，使用了认证次级参考物质，并与CDC维生素D参考实验室使用的24,25(OH)2D3方法进行了方法学比较。

在主要结果方面，qNMR表征赋予了参考物质SI可追溯的纯度值。选择性实验显示，1(α),25(OH)2D2、1(α),25(OH)2D3和25,26(OH)2D3在第一维即与分析物分离，而3-epi-24,25(OH)2D2、3-epi-24,25(OH)2D3和23(S),25(OH)2D3在第二维与分析物达到分辨率≥1.7的基线分离。定量和定性离子对在所有测试基质中均未显示干扰信号，内标中未检出残留未标记分析物。柱后灌注实验未发现明显的离子增强或抑制。标准线斜率比较显示各基质间无显著差异，两种分析物在不同基质中的平均回收率为93–100%。精密度结果显示，24,25(OH)2D2的中间精密度≤2.3%，重复性≤1.4%；24,25(OH)2D3的中间精密度≤2.9%，重复性≤2.1%。对于NIST SRM 972a水平1和水平2，24,25(OH)2D3的平均偏倚分别为−2.4%和−3.7%。在维生素D耗竭血清中，24,25(OH)2D2的平均偏倚为−1.4%至2.9%，24,25(OH)2D3为−0.5%至3.0%；肝素锂血浆中24,25(OH)2D2的平均偏倚为−4.5%至1.5%，24,25(OH)2D3为2.7%至3.6%。线性评估采用二次回归和1/x2加权，相关系数≥0.999，系列稀释实验的回收率在98–113%之间。测量区间下限处的相对偏倚和变异系数均≤2.3%。处理后的样本在6°C下可稳定15天（24,25[OH]2D2）和22天（24,25[OH]2D3），纯添加溶液在−80°C下可稳定80周（24,25[OH]2D2）和70周（24,25[OH]2D3），基质加标校准品和质控品在−80°C下可稳定61周（24,25[OH]2D2）和50周（24,25[OH]2D3）。在方法学比较中，Passing-Bablok回归显示候选RMP与CDC维生素D参考实验室方法的结果高度一致，斜率为1.01（95% CI 0.98–1.04），截距为−0.13（95% CI −0.29至0.01），相关系数r=0.998，患者队列的结果偏倚为−3.2%。对于参考值赋值，24,25(OH)2D2和24,25(OH)2D3的扩展测量不确定度均≤2.5%，满足预期规格（mu<3.3%）。

在结论方面，该研究成功建立了基于同位素稀释-液相色谱-串联质谱（isotope dilution-liquid chromatography-tandem mass spectrometry，ID-LC-MS/MS）的候选参考测量程序，可在人血清和血浆中准确、可重复地定量24,25(OH)2D2和24,25(OH)2D3。这些程序在校准层级中可作为共同的计量学参考，使常规检测程序的制造商能够建立计量溯源性。特别是24,25(OH)2D2候选参考测量程序为首个此类程序，填补了该领域的重要空白。

该研究的亮点包括：首次建立了24,25(OH)2D2的候选参考测量程序；采用qNMR表征参考物质，确保SI单位可追溯性；利用二维中心切割液相色谱结合正交固定相有效消除基质效应和同量异位素干扰；所建立的方法扩展测量不确定度≤2.5%，优于基于生物学变异数据提出的≤3.3%的规格要求。此外，样本前处理方案同时适用于两种分析物，允许从单一样本中同时定量两种代谢物，有利于低样本量检测和大规模方法学比较研究。