由 Ana Gámez-Valero、Marta Monguió-Tortajada、Laura Carreras-Planella、Marcel·la Franquesa、Katrin Beyer 和 Francesc E. Borràs 等研究人员组成的研究团队，于2016年9月19日在 《科学报告》（Scientific Reports） 期刊上发表了题为“与沉淀剂相比，基于尺寸排阻色谱法的分离对细胞外囊泡特性的改变最小”的研究论文。该研究主要在西班牙巴达洛那的 Germans Trias i Pujol 医院健康科学研究所的 REMAR-IVECAT 小组、巴塞罗那自治大学 Germans Trias i Pujol 医院病理科以及 Germans Trias i Pujol 大学医院肾脏科等机构完成。通讯作者为 Francesc E. Borràs。
一、学术背景
本研究属于细胞外囊泡研究领域。细胞外囊泡是由绝大多数真核细胞释放的膜性小泡，在细胞间通讯、疾病进程、作为生物标志物载体以及潜在的药物递送系统等方面具有重要价值，已成为科学界的热门研究领域。然而，该领域发展的一个主要障碍是缺乏共识性的细胞外囊泡分离纯化方法。虽然超速离心技术应用最广，但其流程耗时，难以适应临床实验室的需求，因此催生了多种快速替代方法，例如尺寸排阻色谱法、基于聚乙二醇的沉淀法以及基于丙酮的蛋白质有机溶剂沉淀法。尽管这些快速方法能满足临床生物标志物检测的时效性要求，但它们对所获细胞外囊泡制品的最终成分、污染物含量以及对细胞外囊泡结构/功能本身的影响仍存在争议。本研究旨在填补这一知识空白，系统比较尺寸排阻色谱法、聚乙二醇沉淀法和蛋白质有机溶剂沉淀法这三种方法从血浆样本中分离细胞外囊泡的效果，评估不同方法如何影响所得细胞外囊泡制品的特性，包括蛋白质含量、粒径分布、形态学特征、特异性标志物表达及其对受体细胞的功能性影响，从而为研究人员根据不同的下游应用选择最合适的分离方法提供关键性实验依据。
二、详细研究流程
本研究设计严谨，包含多个连续且平行的实验流程，以全方位评估三种分离方法。
首先，样本采集与处理。研究从健康捐献者采集外周血，严格遵循标准操作以尽量减少血小板及血小板来源囊泡的污染。血液经柠檬酸钠抗凝，在采集后30分钟内处理，通过连续离心步骤（400×g 5分钟去除红细胞，2500×g 10分钟去除血小板，13000×g 5分钟确保获得无血小板血浆）制备血小板游离血浆。所有样本均获得伦理委员会批准并匿名分析。
其次，细胞外囊泡分离。使用相同的2毫升起始血浆样本，平行应用三种分离方法：尺寸排阻色谱法、聚乙二醇沉淀法和蛋白质有机溶剂沉淀法。尺寸排阻色谱法使用 Sepharose CL-2B 层析柱，以 PBS 为洗脱液，收集20个连续的0.5毫升馏分。聚乙二醇沉淀法是将血浆与聚乙二醇6000溶液（终浓度10%）混合，冰上孵育30分钟后，1500×g离心30分钟收集沉淀并重悬。蛋白质有机溶剂沉淀法则是将血浆与预冷的丙酮按1:4体积比混合，涡旋后3000×g离心1分钟，收集上清液进行真空浓缩干燥，最后重悬。
第三，分离产物的表征分析。这是研究的核心部分，涉及多种互补的技术手段： 1. 总蛋白含量测定：使用 NanoDrop 测量 280 nm 处的吸光度，通过牛血清白蛋白标准曲线计算总蛋白浓度，评估不同方法共沉淀可溶性血浆蛋白的程度。 2. 基于微球的流式细胞术：使用醛基/硫酸盐乳胶微球捕获细胞外囊泡，然后通过荧光标记的特异性抗体（抗 CD9、CD63、CD81）检测囊泡表面经典的四跨膜蛋白标志物，用于鉴定尺寸排阻色谱法中的细胞外囊泡阳性馏分，并比较三种方法所得制品中这些标志物的可检测性。 3. 蛋白质印迹分析：进一步检测另外两个已报道的细胞外囊泡标志物——LGALS3BP 和 CD5L。为确保上样量一致，部分样品（如尺寸排阻色谱法馏分）需使用 100 kDa 截留分子量的超滤管进行浓缩。通过该技术评估标志物的存在情况。 4. 纳米颗粒跟踪分析：使用 NanoSight LM10 仪器对三种方法分离的制品进行粒径分布和颗粒浓度分析。样品用 PBS 适当稀释，在标准设置下（检测阈值5，手动控温）捕获60秒视频并分析。 5. 冷冻电子显微镜：选取每种方法最具代表性的样品（尺寸排阻色谱法的阳性馏分池、聚乙二醇沉淀产物、蛋白质有机溶剂沉淀产物），通过快速冷冻制样技术制备玻片，在透射电镜下直接观察囊泡的形态、大小和纯度，这是评估囊泡结构完整性的金标准。 6. 体外细胞功能实验：为了评估分离方法是否影响细胞外囊泡的生物学功能，研究使用人单核细胞系 THP-1 及其衍生的巨噬细胞作为模型。从 THP-1 细胞培养上清液中，使用同样的三种方法分离细胞外囊泡。随后，将分离的细胞外囊泡与靶细胞（THP-1 细胞或 THP-1 来源的巨噬细胞）共培养，分别在30分钟、1小时、3小时和24小时后，通过流式细胞术（7-AAD 染色结合前向/侧向散射）检测细胞活力，评估不同来源的细胞外囊泡对受体细胞的潜在毒性或影响。
最后，数据分析。使用 GraphPad Prism 软件进行统计学分析。多组间比较采用单因素或双因素方差分析，随后进行 Tukey 检验。P 值小于 0.05 被认为具有统计学显著性。
三、主要研究结果
研究结果清晰地展示了三种分离方法对细胞外囊泡制品特性的显著不同影响，逻辑链条完整。
关于总蛋白含量，聚乙二醇沉淀法产物的蛋白质含量最高（21.1 ± 10.4 mg），意味着该方法沉淀了大量可溶性血浆蛋白污染物；蛋白质有机溶剂沉淀法次之（3.9 ± 1.1 mg）；而尺寸排阻色谱法在细胞外囊泡富集的馏分池中蛋白质含量最低（0.3 ± 0.3 mg），表明其能有效去除绝大部分高丰度血浆蛋白。这一结果为后续蛋白质组学分析的可靠性奠定了基础，提示使用沉淀法时，囊泡相关蛋白信号可能被掩盖。
在细胞外囊泡标志物检测方面，差异更为明显。基于微球的流式显示，尺寸排阻色谱法分离的细胞外囊泡能明确检测到 CD9、CD63 和 CD81 三种四跨膜蛋白。而聚乙二醇沉淀法产物仅能检测到 CD9，CD63 和 CD81 信号缺失。蛋白质有机溶剂沉淀法则完全无法检测到任何一种四跨膜蛋白。蛋白质印迹结果与此呼应：尺寸排阻色谱法和聚乙二醇沉淀法制品中可检测到 LGALS3BP 和 CD5L，而蛋白质有机溶剂沉淀法的三种浓缩处理样品均未检测到这两种标志物。这些结果表明，沉淀剂可能改变或掩蔽了细胞外囊泡的表面表位或整体结构，影响了抗体结合。
纳米颗粒跟踪分析和冷冻电镜结果从物理特性上提供了关键证据。纳米颗粒跟踪分析显示，尺寸排阻色谱法和聚乙二醇沉淀法分离的颗粒主要粒径模式在 116 nm 左右，而蛋白质有机溶剂沉淀法的颗粒平均粒径更大（136 nm），且分布曲线显示存在多个峰，包括超过 200 nm 的颗粒。冷冻电镜图像直观地证实了这些差异：尺寸排阻色谱法制品主要为单个、独立的囊泡，大小在 80-200 nm 之间，污染物极少；聚乙二醇沉淀法制品在电镜下未观察到典型囊泡结构，而是被致密的污染物聚集体覆盖；最值得注意的是，蛋白质有机溶剂沉淀法制品中的囊泡大多呈现为同心圆多层结构的多层囊泡，直径多在 300-500 nm 之间，这解释了纳米颗粒跟踪分析中观察到的粒径增大现象，并强烈提示丙酮处理可能导致囊泡融合或诱导形成人工多层结构。
最后的细胞功能实验将结构差异与生物学后果联系起来。体外细胞活力实验表明，与对照（PBS）相比，用尺寸排阻色谱法分离的细胞外囊泡处理细胞，在各个时间点对 THP-1 细胞及其衍生巨噬细胞的活力均无明显影响。然而，聚乙二醇沉淀法分离的囊泡在短时间（1-3小时）内即显著降低了巨噬细胞的活力。而蛋白质有机溶剂沉淀法分离的囊泡则在长时间（24小时）培养后，对 THP-1 细胞和巨噬细胞均表现出显著的细胞毒性，导致细胞活力大幅下降。这直接证明，不同的分离方法不仅改变了囊泡的物理化学特性，还可能严重影响其生物相容性和潜在功能，对于治疗性应用至关重要。
四、研究结论与价值
本研究得出结论：与聚乙二醇沉淀法和蛋白质有机溶剂沉淀法相比，基于尺寸排阻色谱法的分离方法能最大限度地减少对细胞外囊泡特性的改变。尺寸排阻色谱法能有效去除可溶性血浆蛋白污染物，保持囊泡的单个形态和经典表面标志物的可检测性，并且所得囊泡制品在体外不表现出细胞毒性。相反，两种沉淀法都会引入不同程度的污染物，可能改变或掩蔽囊泡标志物，并可能诱导囊泡结构异常（如融合或多层化），甚至对受体细胞产生毒性作用。
本研究的科学价值在于，它首次通过多参数、系统的头对头比较，揭示了快速沉淀方法在用于细胞外囊泡分离时所固有的、可能被低估的局限性。它强调了选择分离方法时必须考虑其下游应用场景：对于旨在发现新型生物标志物的蛋白质组学研究，尺寸排阻色谱法因其高纯度而更具优势；对于需要评估细胞外囊泡天然生物学功能或将其用于治疗目的的研究，尺寸排阻色谱法是更安全可靠的选择；而沉淀法则可能因其简便快捷，在特定诊断场景中仍有其用武之地，但研究者必须清醒认识到其可能带来的干扰和假象。
五、研究亮点
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：1. 系统性比较：研究设计全面，结合了蛋白质定量、多标志物检测（流式+蛋白质印迹）、物理表征（纳米颗粒跟踪分析+冷冻电镜）和功能性验证（细胞活力）等多种技术，从多个维度综合评价分离方法的效果。2. 关键性发现：首次通过冷冻电镜直接观察并报道了蛋白质有机溶剂沉淀法会导致细胞外囊泡形成同心圆多层结构，这一发现对解释其标志物检测失败和功能改变提供了关键的结构性证据。3. 明确的警示与应用指导：研究结果不仅停留在表征层面，更通过细胞毒性实验，明确指出了不当分离方法在治疗应用中的潜在风险，为整个领域提供了重要的方法学参考和警示。4. 临床转化意义：研究直面细胞外囊泡临床应用（如作为生物标志物和疗法）中的核心瓶颈问题——标准化、可靠的分离方法，其结论对推动细胞外囊泡研究的临床转化具有直接的指导意义。