本文报道了一项由浙江大学医学院附属第二医院眼科中心的华世源（Shiyuan Hua）与感染科的胡慧群（Huiqun Hu）作为共同第一作者完成，由感染科徐峰（Feng Xu）和眼科中心周民（Min Zhou）作为共同通讯作者指导的原创性研究。该研究于2024年11月7日发表于《ACS Nano》期刊（第18卷，第31923–31940页），DOI为10.1021/acsnano.4c09695。研究团队还包括来自浙江大学爱丁堡大学联合学院（ZJU-UoE Institute）及南京医科大学附属常州第二人民医院的多位合作者。
细菌性肺炎是全球最具挑战性的感染性疾病之一，具有高发病率和高死亡率。目前临床最常用的治疗策略是抗生素治疗，但由于细菌耐药性问题和抗生素滥用，其应用受到严重限制。此外，细菌可以形成生物被膜（biofilm），包裹在生物被膜基质中的细菌对抗生素的耐受性远高于浮游细菌，顽固的生物被膜极大地削弱了杀菌效果。
近年来，多种金属基抗菌材料被广泛应用于抗菌领域。大多数金属基抗菌材料主要通过光动力治疗产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）来破坏细菌生物被膜并发挥广谱抗菌作用。然而，由于肺部的高氧环境，一些需氧感染细菌对氧气和ROS具有高度耐受性，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PAO1）。因此，单纯基于ROS的金属抗菌材料可能无法获得良好的治疗效果，亟需开发具有其他机制或协同作用的抗菌材料。
铜作为一种历史悠久的抗菌材料，近年来被发现其积累后可触发铜诱导的细胞死亡——铜死亡（cuproptosis）。铜诱导的细胞死亡与细胞呼吸相关，依赖有氧呼吸的细胞对铜诱导的死亡更为敏感，这显示出其在肺部需氧感染治疗中的潜在应用价值。然而，铜死亡样死亡在细菌感染治疗中的应用受到限制：首先，谷胱甘肽（glutathione, GSH）的保护作用会与铜相互作用，阻碍铜与蛋白质的结合；其次，铜死亡样死亡需要大量的铜离子，而大剂量铜制剂的静脉注射会导致严重的全身毒性。
基于上述问题，本研究设计了一种铜-锰复合纳米颗粒（Cu-Mn NPs），旨在通过局部给药实现肺部感染部位的有效铜富集，利用二氧化锰消耗保护性GSH并增强免疫应答，同时利用感染部位的酸性微环境实现铜离子的快速释放，从而通过铜死亡样死亡机制高效杀灭肺部需氧细菌和生物被膜。
研究首先通过铜离子（CuCl₂）与没食子酸（gallic acid, GA）的络合反应制备了GA-Cu纳米颗粒，同时利用GA还原高锰酸钾（KMnO₄）制备了二氧化锰纳米颗粒（MnO₂ NPs）。随后将两种溶液混合，加入壳聚糖（chitosan, CS）形成纳米颗粒并调节zeta电位，最后在表面修饰聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）以增强肺黏液层穿透能力。
表征结果显示，GA-Cu的吸收峰位于270 nm，粒径约3.1 nm；MnO₂的吸收峰位于250 nm，粒径约68.1 nm。经CS和PEG包覆后，Cu-Mn NPs的流体动力学直径增大，zeta电位变为正值（CS包覆后约+15.8 mV，PEG修饰后约+8.5 mV），有利于穿透肺部黏液屏障。透射电子显微镜（TEM）显示纳米颗粒基本呈球形，能量色散光谱（EDS）分析证实Cu和Mn元素在颗粒内部均匀分布。铜离子释放曲线显示，Cu-Mn NPs能够持续释放Cu²⁺，且在炎症弱酸性环境（pH = 6.0）下释放速率进一步提高。
锰是环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase, cGAS）的直接激活剂，可激活cGAS-STING信号通路，最终产生I型干扰素（IFN-I）和促炎细胞因子。研究通过蛋白免疫印迹（Western blot, WB）检测了小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S细胞）中相关蛋白的表达水平，发现MnO₂组和Cu-Mn NPs组中cGAS水平轻度上调，磷酸化TBK1（p-TBK1）水平显著上调。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测显示IFN-α和IFN-β水平在MnO₂组和Cu-Mn NPs组均明显升高，证实了cGAS-STING通路的激活。同时，GA-Cu和Cu-Mn NPs处理的细胞上清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）水平均显著增加，表明Cu-Mn NPs可激活巨噬细胞的促炎反应，增强其识别、吞噬和杀菌能力。
在黏液渗透性研究中，研究者制备了由海藻酸钠、D-(+)-葡萄糖酸-δ-内酯、猪胃黏蛋白和碳酸钠组成的人工黏液。经考马斯亮蓝染色的Cu-Mn NPs在人工黏液中的渗透实验显示，Cu-Mn NPs比未修饰的Cu-Mn具有更好的穿透能力。Transwell定量实验进一步证实，在相同时间点，Cu-Mn NPs组穿透人工黏液的铜离子含量更多。
研究测定了Cu-Mn NPs对MRSA的最低抑菌浓度（MIC）为125 μg/mL。时间-浓度依赖杀菌实验显示Cu-Mn NPs具有浓度和时间依赖性的杀菌活性，最低杀菌浓度为500 μg/mL。平板涂布法比较了GA-Cu、MnO₂和Cu-Mn NPs的抗菌活性，Cu-Mn NPs表现出最优的抗菌效果。活/死细菌染色实验（SYTO 9/PI染色）同样显示Cu-Mn NPs组红色荧光最强，表明杀菌效果最佳。TEM观察发现，对照组细菌保持正常形态（完整细胞壁、光滑细胞膜、均匀致密的细胞质），而处理组出现不同程度的细菌溶解、细胞壁破裂、细胞膜收缩和胞质内容物泄漏。
在膜完整性实验中，DiSC₃(5)荧光探针检测显示Cu-Mn NPs组绿色荧光最强，表明细菌膜电位去极化最严重，膜损伤最明显。BCA蛋白泄漏检测也验证了处理组均出现显著的蛋白泄漏。
生物被膜实验中，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、结晶紫染色和活菌定量被用于评估抗生物被膜能力。对未成熟生物被膜（0 h处理）的抑制实验显示，GA-Cu、MnO₂和Cu-Mn NPs的抑制率分别约为74.3%、41.1%和10.1%。对成熟生物被膜（24 h形成后处理）的破坏实验结果与抑制实验基本一致，Cu-Mn NPs对成熟生物被膜具有优异的破坏能力。
研究对Cu-Mn NPs处理后的MRSA进行了转录组测序（RNA-seq）分析。共鉴定出2714个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），其中837个基因上调，821个基因下调。GO富集分析显示与氧化还原酶活性相关的基因数量变化最大，与金属离子响应和细胞溶解相关的基因p值较大。KEGG富集分析表明Cu-Mn NPs主要影响细菌代谢，包括脂质代谢、能量代谢、氨基酸代谢和碳水化合物代谢。
热图分析显示，群体感应（quorum sensing, QS）系统、双组分系统（two-component system, TCS）和金黄色葡萄球菌感染相关的基因在Cu-Mn NPs处理后均下调，关键毒力基因如*agrA*、*agrB*、*hld*和*hlg*的表达均显著降低。此外，与三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle, TCA cycle）、丙酮酸代谢和糖酵解相关的大量基因下调，与GSH合成相关的基因下调，而与GSH降解和氧化应激相关的基因上调。DNA复制和修复相关基因也呈现下调。
DCFH-DA探针检测显示Cu-Mn NPs组绿色荧光最强，表明ROS水平最高。丙二醛（MDA）检测和BODIPY 581⁄591-C11探针均证实Cu-Mn NPs组脂质过氧化水平最高。GSH/GSSG比值检测证实Cu-Mn NPs能够破坏GSH/GSSG平衡。丙酮酸含量检测显示Cu-Mn NPs组丙酮酸积累明显。呼吸链复合物I、II、III、IV活性检测证明Cu-Mn NPs能够同时抑制细菌呼吸链功能。铜含量检测显示Cu-Mn NPs组有明显的铜积累。乙二胺四乙酸（EDTA）作为铜死亡样死亡的抑制剂，以浓度依赖性方式抑制了Cu-Mn NPs的杀菌活性，进一步证实Cu-Mn NPs的抗菌作用依赖于诱导铜死亡样死亡。γ-H2AX免疫荧光染色显示Cu-Mn NPs组DNA损伤最严重。
在体内实验中，研究者通过气管内注射IR783标记的Cu-Mn NPs评估其肺滞留能力。离体荧光成像显示在注射后2、4、10、24和48 h肺组织均有显著荧光信号，96 h时几乎所有器官均无荧光，证明Cu-Mn NPs在肺组织中可滞留超过48 h且能完全代谢。
急性MRSA肺炎小鼠模型实验中，感染后12 h经气管给予Cu-Mn NPs治疗，36 h后取肺组织匀浆检测细菌负荷。平板涂布法显示Cu-Mn NPs具有最优的体内抗菌效果。肺组织照片显示PBS组有明显肺出血和水肿，Cu-Mn NPs组症状最轻。肺湿/干重比显示Cu-Mn NPs组水肿最轻。致死剂量MRSA感染的小鼠存活率实验中，PBS组72 h内全部死亡，而Cu-Mn NPs组存活率升至70%。核心体温监测显示Cu-Mn NPs组体温维持在约35°C，而PBS组降至约29°C。
H&E染色显示Cu-Mn NPs组肺泡组织结构相对清晰，仅有小面积水肿和局部炎性细胞浸润，肺损伤评分最低。免疫组化分析显示Cu-Mn NPs组髓过氧化物酶（MPO）表达最低（中性粒细胞浸润最少），核因子κB（NF-κB）表达显著降低（炎症减轻）。ELISA检测显示Cu-Mn NPs组肺组织中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平最低。
14天长期毒性研究显示，GA-Cu、MnO₂和Cu-Mn NPs处理组健康小鼠的血生化指标和血常规指标均保持在正常范围内，主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的组织学检查显示良好的体内生物相容性。溶血实验和细胞活/死染色实验也证实了材料的安全性。
本研究成功设计了一种铜-锰复合抗菌纳米系统，能够有效诱导肺部感染细菌的铜死亡样死亡。通过负载二氧化锰，快速消耗细菌内的GSH，减少其对铜死亡的保护作用，同时产生的锰离子通过免疫增强辅助抗菌。为满足铜死亡对高浓度铜离子的需求，研究采用局部给药方式增加肺部铜蓄积，避免了全身毒性。通过正电荷和亲水性材料修饰，Cu-Mn NPs有效提高了肺黏液层穿透能力，并利用感染部位酸性微环境实现铜离子的快速释放，有效治疗了小鼠细菌性肺炎。
本研究的科学价值在于：首次将铜死亡样死亡机制成功应用于肺部需氧细菌感染的治疗，克服了传统ROS基抗菌材料在肺部高氧环境中疗效不佳的局限；创新性地将二氧化锰的GSH消耗功能与铜死亡机制相结合，实现了协同抗菌效果；通过正电荷和PEG修饰解决了肺黏液屏障的穿透难题。
本研究的应用价值在于：该纳米系统具有广谱抗菌活性（对革兰氏阳性菌MRSA和革兰氏阴性菌PAO1均有效），同时具备抑制未成熟生物被膜形成和破坏成熟生物被膜的能力；通过局部给药避免了全身毒性，具备良好的生物相容性和临床转化潜力。
本研究的核心亮点包括：（1）提出了一种基于铜死亡样死亡的全新抗菌机制，不同于传统ROS依赖的杀菌途径；（2）利用MnO₂的双重功能——GSH消耗和免疫激活——有效放大了铜死亡效应；（3）通过转录组学系统揭示了Cu-Mn NPs的多靶点抗菌机制，包括抑制TCA循环、阻断QS和TCS系统、降低细菌毒力、破坏膜完整性和诱导DNA损伤等；（4）构建了黏液穿透型纳米递送系统，解决了肺部局部给药的屏障问题，且具有酸响应释放特性，实现了感染微环境的精准靶向。