基于人诱导多潜能干细胞来源的脑微血管内皮细胞探究Aβ肽对血脑屏障完整性和葡萄糖代谢的影响

一、 研究基本信息

本研究由美国德克萨斯理工大学健康科学中心Jerry H. Hodge药学院药物科学系的Snehal Raut, Ronak Patel, Iqra Pervaiz和通讯作者Abraham J. Al-Ahmad*共同完成。研究成果以“Abeta peptides disrupt the barrier integrity and glucose metabolism of human induced pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells”为题，发表于2022年的《Neurotoxicology》期刊（第89卷，第110-120页）。

二、 学术背景与研究目的

本研究属于神经科学、血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）病理生理学及阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）的交叉领域。

研究背景：阿尔茨海默病和脑淀粉样血管病（Cerebral Amyloid Angiopathy, CAA）的共同特征是淀粉样β（Amyloid beta, Aβ）肽在大脑内或脑血管周围形成斑块沉积。大量研究表明，Aβ肽在体内对血脑屏障具有有害影响。然而，Aβ肽如何对脑微血管产生作用的细胞和分子机制尚不清楚。血脑屏障在维持大脑稳态中至关重要，它由脑微血管内皮细胞（Brain Microvascular Endothelial Cells, BMECs）等构成，负责选择性运输营养物质并清除代谢废物（包括Aβ肽）。现有研究揭示了BBB功能障碍与AD病理的关联，尤其是Aβ肽的清除机制和其累积对BBB完整性的损害。传统BBB体外模型（如原代或永生化的BMECs）常存在屏障功能有限或丢失的问题。相比之下，人诱导多潜能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）分化的BMECs为构建具有稳定屏障功能的人源BBB模型提供了新途径。

研究目的：本研究旨在利用iPSC来源的BMECs体外模型，评估两种主要的Aβ肽（Aβ40和Aβ42）对BBB功能的影响，重点关注屏障功能、外排转运体活性、葡萄糖摄取和细胞能量代谢等方面的变化，以期阐明Aβ损害BBB的可能机制。

三、 详细研究流程

研究采用了系统性的体外实验方法，主要包括细胞培养模型建立、Aβ处理以及一系列功能与分子检测。具体流程如下：

1. 细胞模型建立与分化：研究使用了iPSC（IMR90）-C4细胞系。按照已发表的“Shusta”方案进行分化。简而言之，将未分化的iPSCs在基质胶上培养4天，然后使用无血清条件培养基诱导分化6天，接着转换到含有成纤维细胞生长因子和视黄酸的特定内皮细胞培养基中培养2天。在第8天，通过酶消化获得分化的BMECs，并将其接种于经胶原和纤连蛋白包被的组织培养板或Transwell小室上。第9天，细胞在无生长因子的培养基中维持，此时已形成紧密连接的单层（跨内皮电阻 >1000 Ω·cm²），并可在后续2-3天内保持此屏障特性用于实验。

2. Aβ肽制备与细胞处理：购买人源Aβ1-40和Aβ1-42冻干粉，用二甲基亚砜（DMSO）配制成储存液。实验时，使用100 nM浓度的Aβ肽（工作液中DMSO含量≤0.1%）处理iPSC-BMECs单层，持续48小时。所有实验（除细胞毒性试验外）均采用此处理条件。研究者同时使用硫黄素T荧光测定法确认了在实验所用培养基中，Aβ40和Aβ42均可在数小时内发生聚集，形成寡聚体或原纤维。

3. 细胞毒性评估：使用MTS法评估Aβ肽对细胞代谢活性的影响。将iPSC-BMECs接种于96孔板，分别用不同浓度（1 nM 至 1 μM）的Aβ40或Aβ42处理24、48和72小时，然后检测细胞活性。

4. 屏障功能评估：

   • 跨内皮电阻（Transendothelial Electrical Resistance, TEER）：使用STX2电极测量处理48小时后的细胞单层TEER值。
   • 通透性测定：在Transwell小室的顶侧腔室加入10 μM荧光素钠（一种旁细胞途径示踪剂），在60分钟内从底侧腔室定时取样，通过清除斜率法计算其通透系数。

5. 紧密连接蛋白表达分析：通过免疫荧光和免疫印迹法，检测经100 nM Aβ肽处理48小时后，细胞中关键紧密连接蛋白（Claudin-5， Occludin， ZO-1）的表达水平和定位变化。

6. 外排转运体功能评估：

   • P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）表达：通过免疫荧光检测P-gp的表达。
   • 外排转运活性：分别使用罗丹明123（Rhodamine 123， P-gp底物）和阿霉素（广谱外排底物）进行摄取实验。细胞经Aβ处理后，与荧光底物共孵育1小时，裂解细胞后测定胞内荧光强度（用总蛋白量归一化），荧光强度越高表示外排转运体活性越低。

7. Aβ40摄取与跨膜转运研究：

   • 摄取动力学：在Transwell小室顶侧加入100 nM Aβ40，在不同时间点收集细胞裂解液，使用人Aβ40 ELISA试剂盒定量细胞内的Aβ40含量（扣除内源性产生的背景值）。
   • 转运方向性：比较Aβ40从顶侧到基底侧（A-to-B）和从基底侧到顶侧（B-to-A）的转运速率（通透系数），并研究温度（4°C）对转运的影响，以判断其是否为主动转运过程。

8. 葡萄糖代谢功能评估：

   • 葡萄糖转运蛋白1表达：使用流式细胞术和免疫荧光检测经Aβ处理48小时后，葡萄糖转运蛋白1的表达变化。
   • 葡萄糖摄取：使用放射性标记的2-脱氧葡萄糖，测定细胞对葡萄糖的摄取能力。
   • 葡萄糖跨膜扩散：测量放射性标记的葡萄糖通过细胞单层的清除率。
   • 细胞能量代谢谱：使用Seahorse XF细胞能量代谢分析仪，分别进行糖酵解压力测试和线粒体压力测试，实时监测细胞外酸化率（Extracellular Acidification Rate, ECAR）和耗氧率（Oxygen Consumption Rate, OCR），评估糖酵解和氧化磷酸化功能。

9. 氧化应激与Akt信号通路检测：

   • 活性氧水平：使用CellROX荧光探针进行定性观察，并使用DCFDA荧光探针进行半定量检测。
   • Akt信号通路：通过ELISA法检测总Akt蛋白及其磷酸化形式（pS473-Akt）的水平。

10. 数据统计：所有数据均表示为至少三次独立生物学重复的平均值±标准差。使用GraphPad Prism软件进行统计分析，采用单因素方差分析（ANOVA）及事后Dunnett检验比较处理组与对照组，p < 0.05被认为具有统计学显著性。

四、 主要研究结果

1. Aβ肽对iPSC-BMECs细胞活性的影响：MTS实验表明，在高达1 μM的浓度下处理48小时，Aβ40和Aβ42均未显著降低细胞代谢活性，表明iPSC-BMECs对Aβ肽具有耐受性。但在更长（72小时）或更短（24小时）的时间点，观察到了时间依赖性和浓度依赖性的代谢活性波动，提示Aβ可能存在复杂的细胞调节作用。

2. Aβ肽损害屏障完整性：TEER和荧光素通透性实验结果显示，Aβ40以剂量依赖性的方式降低TEER值（10 nM起效）并增加通透性（100 nM起效）。使用100 nM Aβ40或Aβ42处理48小时，两者均能显著破坏屏障功能，且Aβ40的作用趋势更强。这与免疫荧光和免疫印迹结果一致：Aβ处理（尤其是Aβ42）显著降低了Occludin蛋白的表达水平，而对Claudin-5和ZO-1的影响较小，表明Aβ可能通过选择性下调特定紧密连接蛋白来破坏屏障结构。

3. Aβ肽下调P-gp表达与功能：免疫荧光显示，Aβ40和Aβ42处理均显著降低了P-gp的表达。功能实验进一步证实，Aβ40处理组的细胞对P-gp底物罗丹明123和阿霉素的摄取显著增加，意味着其外排功能被抑制。这提示，长期暴露于高浓度Aβ可能形成一个恶性循环：Aβ损害了负责将其清除出脑的P-gp功能，导致更多Aβ在血管周围积累。

4. iPSC-BMECs主动摄取和外排Aβ40：摄取动力学实验表明，细胞能快速摄取Aβ40，并在30分钟后达到一个平台期。转运实验显示，Aβ40通过单层的速率显著高于同等大小的FITC-葡聚糖，且其从基底侧到顶侧的转运（B-to-A）速率高于反向（A-to-B），表现出极化外排特征。低温（4°C）能显著抑制此转运，证明该过程是能量依赖的主动转运。这为iPSC-BMECs模型能够模拟体内BBB的Aβ清除功能提供了直接证据。

5. Aβ肽损害葡萄糖转运与细胞能量代谢：

   • 葡萄糖摄取与转运蛋白：Aβ40处理以剂量依赖的方式降低了葡萄糖转运蛋白1的表达和细胞对葡萄糖的摄取（100 nM起效）。100 nM Aβ42处理也显著降低了葡萄糖摄取和葡萄糖转运蛋白1的表达，且两种Aβ肽均损害了葡萄糖转运蛋白3的表达。
   • 能量代谢谱：Seahorse分析揭示了Aβ肽对细胞生物能量学的深刻影响。对照组细胞主要依赖糖酵解供能。Aβ40处理使细胞的代谢谱向糖酵解和氧化磷酸化混合型偏移，并耗竭了糖酵解储备。Aβ42处理的影响更为严重，导致非糖酵解酸化和糖酵解能力异常，并严重破坏了线粒体功能，表现为基础呼吸降低、非线粒体耗氧增加和备用呼吸容量异常升高。

6. Aβ肽诱导氧化应激并影响Akt信号：CellROX和DCFDA检测均显示，Aβ处理（尤其是Aβ42）增加了细胞内活性氧水平。此外，Aβ处理降低了总Akt蛋白水平，而Aβ42处理增加了其磷酸化形式pS473-Akt的水平，表明Akt信号通路被扰动。

五、 结论与研究价值

结论：本研究证实，iPSC来源的BMECs模型能够重现Aβ肽在体内及其他模型中观察到的多种有害效应。具体而言，Aβ40和Aβ42肽能够： 1）破坏BBB的结构和功能完整性，主要与Occludin蛋白下调有关； 2）抑制外排转运体P-gp的表达和功能，可能削弱BBB对Aβ的清除能力； 3）显著降低葡萄糖转运蛋白（葡萄糖转运蛋白1和葡萄糖转运蛋白3）的表达和葡萄糖摄取； 4）严重扰乱内皮细胞的能量代谢状态，损害糖酵解和线粒体功能； 5）诱导氧化应激并干扰Akt信号通路。 这些多靶点的损害作用共同表明，Aβ肽可能通过直接作用于脑微血管内皮细胞，从多个层面（结构、清除、营养供应、能量代谢）协同破坏BBB的稳态，进而参与AD和CAA的血管病理过程。

科学价值： 1. 模型验证：有力证明了人iPSC-BMECs模型在研究BBB与Aβ相互作用方面的有效性和优越性，该模型兼具人源性、可重复性及稳定的屏障功能。 2. 机制深化：系统揭示了Aβ对BBB损害的多个新维度，特别是其对葡萄糖代谢和细胞能量学的严重影响，将血管功能障碍与神经元能量危机更直接地联系起来。 3. 病理关联：为理解AD中观察到的BBB渗漏、葡萄糖代谢减退和线粒体功能障碍提供了基于血管内皮细胞的细胞机制解释。 4. 应用前景：该模型可用于筛选保护BBB功能、改善脑内皮细胞代谢或促进Aβ清除的潜在药物，为AD的血管靶向治疗策略提供新的研究平台和思路。

六、 研究亮点

1. 研究模型新颖且可靠：采用人iPSC分化的BMECs作为BBB模型，克服了传统模型的局限性，为人源化、可定制化的BBB病理研究提供了强大工具。
2. 研究内容系统全面：不是单一关注屏障通透性，而是整合评估了屏障结构、转运体功能、营养代谢、细胞生物能量学、氧化应激和信号通路等多个相互关联的层面，提供了关于Aβ对内皮细胞影响的整体视图。
3. 揭示了Aβ对BBB能量代谢的关键影响：详细阐明了Aβ如何损害脑内皮细胞的葡萄糖摄取和利用，以及糖酵解与线粒体呼吸功能的紊乱，这一发现对于理解AD全脑代谢障碍具有重要意义。
4. 机制探索深入：不仅观察现象，还通过温度敏感性实验、方向性转运实验等，初步探讨了Aβ跨BBB转运的主动外排机制，并关联了P-gp功能下调。

七、 其他有价值的内容

研究发现，尽管Aβ40和Aβ42在许多表型上作用相似，但存在一些差异：例如在细胞毒性时间曲线、对屏障破坏的程度（Aβ40趋势更强）、以及对细胞能量代谢谱的扰动模式上（Aβ42对线粒体的影响更特异且剧烈）。研究者推测这可能与两种肽在溶液中聚集动力学的差异有关，Aβ42更易形成寡聚体。这提示未来研究需要更精细地界定不同聚集状态Aβ物种的特异性毒性，这也是本研究指出的未来方向之一。此外，研究中观察到的iPSC-BMECs对Aβ的快速、极化外排，为利用此模型深入研究LRP1、RAGE等具体受体介导的Aβ转运机制奠定了基础。