本研究由Ahmed Zahoor、Katrin Messerschmidt、Simon Boecker和Steffen Klamt等人完成，其中Ahmed Zahoor和Katrin Messerschmidt为共同第一作者，Steffen Klamt为通讯作者。研究团队来自德国马格德堡马克斯·普朗克复杂技术系统动力学研究所的生物网络分析与重构实验室。该论文于2020年发表在期刊《Biotechnology for Biofuels》上，文章DOI为10.1186/s13068-020-01822-9。
一、研究背景与目的
化石燃料目前仍是全球主要的能源和化学品来源，但其有限性、分布不均以及燃烧产生的温室气体排放等问题促使人们寻求可持续的生物燃料替代方案。生物乙醇是生物技术领域在经济规模和产量上最大的产品，全球年产量已超过1000亿升，预计到2024年将突破1340亿升。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是生产生物乙醇的主要微生物，因其高效的厌氧乙醇生产能力、对乙醇和低pH等胁迫因素的耐受性以及对噬菌体感染的不敏感性而成为理想的工业宿主。乙醇产率仅提高1%，每年就可为工业界节省数百万美元。
强化ATP浪费（enforced ATP wasting）已被认为是一种有前景的代谢工程策略，可用于提高与ATP生成偶联的微生物代谢产物的产量。该策略的核心原理是：乙醇合成与ATP产生双向偶联，即乙醇合成产生ATP，而（平衡的）ATP合成意味着必须合成乙醇；因此，人为引入ATP水解活性会导致细胞内ATP损失，细胞必须通过增加ATP合成来补偿，从而推动更多乙醇的生成。在以往研究中，有多种实现ATP浪费的方法被尝试，如用Entner–Doudoroff（ED）途径替代Embden–Meyerhof–Parnas（EMP）糖酵解途径以降低ATP产率、利用无效循环（futile cycles）消耗ATP、以及表达直接水解ATP的ATP酶（ATPase）等。其中，表达可溶性F1-ATPase被认为是最直接、最简便且不易干扰其他代谢物的方法。F1-ATPase是F0F1-ATP合酶的可溶性部分，由α₃β₃γδε五种亚基组成，其中α₃β₃γ是旋转马达的最小组成，β亚基是催化位点。然而，此前在酿酒酵母中的相关研究存在诸多不足：有些采用了非ATP酶的ATP浪费机制、有些使用复杂培养基或半乳糖诱导剂影响产率计算、多数研究缺乏生长和产物形成的全面数据、且未考察生长解偶联条件下的表现。
本研究的目的是在酿酒酵母中通过异源表达ATP酶基因实现对ATP浪费策略的构建，并系统表征工程菌株在生长、乙醇生产和底物利用方面的表现。
二、研究流程与实验设计
研究团队首先选择了三种ATP酶表达变体：第一种是来自里氏木霉（Trichoderma reesei）的F1-ATPase β亚基基因（atp2），该亚基与酿酒酵母同为真菌来源，且缺少线粒体信号肽，因此可在细胞质中发挥ATPase活性；第二和第三种均基于大肠杆菌（Escherichia coli）的F1-ATPase α、β和γ亚基基因。其中第二种变体（atpagd）使用单独的启动子和终止子分别控制每个亚基基因的表达；第三种变体（atpagd (2a)）则利用病毒2A肽序列（来自马鼻炎B病毒ERBV-1和猪捷申病毒PTV）将三个亚基基因连接在一个多顺反子转录本中表达，从而减少启动子和终止子的重复使用，使构建体大小比单独启动子版本缩小了27%以上。
他们首先尝试通过CRISPR-Cas9无标记整合技术将单拷贝的atp2基因或经2A序列连接的大肠杆菌atpagd基因整合到原养型菌株CEN.PK113-7D的X染色体X2位点，获得了菌株7D-atp2和7D-atpagd (2a)。但这两株菌未表现出显著的ATPase活性，对生物质和乙醇产量也无明显影响。随后，他们改用基于2µ复制起点和stb稳定位点的游离质粒pRSII326，将三种ATP酶基因变体分别导入尿嘧啶营养缺陷型菌株CEN.PK113-5D中，获得菌株5D-atp2、5D-atpagd和5D-atpagd (2a)，以及携带空载体的对照菌株5D (e.v.)。
所有菌株均在矿物盐基本培养基中培养，以排除复杂培养基对产率计算的影响。对于厌氧生长偶联实验，菌株在含0.4%葡萄糖的矿物盐培养基中于30°C厌氧培养，从2.5小时到7小时（所有菌株均处于指数生长期）计算比速率和体积速率，并从0到10小时整个培养期计算产率。对于生长解偶联（氮饥饿）实验，细胞先在含氮培养基中培养6–8小时，然后转入无氮培养基中培养10–11小时以耗尽胞内氮储备，最后接种到无氮且含0.4%葡萄糖的培养基中，在较高起始OD600（约2.5）下孵育10小时，保持生物量基本恒定。ATPase活性通过Biovision公司的比色法ATPase活性检测试剂盒测定，并归一化至裂解液总蛋白含量。葡萄糖、乙醇、甘油和乙酸盐浓度通过配备Rezex-ROA色谱柱的Agilent 1100系列HPLC系统定量。比速率在生长偶联实验中用公式r = µ(c{m,e}−c{m,s})/(c{x,e}−c{x,s})计算，在生长解偶联实验中因生物量基本恒定而用r = (c{m,e}−c{m,s})/x_{av}/Δt计算；产率通过对产物生成量与葡萄糖消耗量作图并进行线性回归求得斜率。
三、主要实验结果
ATPase活性测定显示，与对照菌株5D (e.v.)相比，表达大肠杆菌F1-ATPase三个亚基基因的两株菌5D-atpagd和5D-atpagd (2a)的ATPase活性分别显著提高了78%和103%，与在大肠杆菌中过表达这些基因时的活性增加范围相当。而表达里氏木霉β亚基的菌株5D-atp2的ATPase活性反而下降了21%，首次暗示该菌株可能未按预期发挥作用。
在厌氧生长偶联条件下，对照菌株虽然已达到最大理论乙醇产率的约80%，但表达大肠杆菌F1-ATPase的菌株仍显著提高了乙醇产率：5D-atpagd提高了超过9%，5D-atpagd (2a)提高了超过10%，而5D-atp2仅有2.5%的微弱改善。比葡萄糖摄取速率在5D-atp2和5D-atpagd中降低，但在5D-atpagd (2a)中几乎与对照相同，使该菌株的比乙醇生产率比对照提高了10%。通过通量平衡计算估计的非生长相关ATP维持需求（r_atp-ngam）与乙醇产率明显相关：对照菌株为0.30 mmol/gCDW/h，5D-atpagd为8.33 mmol/gCDW/h，5D-atpagd (2a)为9.59 mmol/gCDW/h。ATPase表达对生物量形成产生了显著影响：5D-atp2和5D-atpagd的生长速率下降了35%，5D-atpagd (2a)下降了26%。生物量减少直接影响了体积乙醇生产率，5D-atp2和5D-atpagd分别下降了45%和10%，而5D-atpagd (2a)仅下降1%。
在生长解偶联（氮饥饿）条件下，所有菌株的生物量浓度在10小时培养期间基本保持恒定。表达大肠杆菌F1-ATPase的两株菌5D-atpagd和5D-atpagd (2a)的比葡萄糖摄取速率和比乙醇生产率显著高于对照菌株。相应地，这两株菌的体积生产率分别相对提高了44%以上和111%，从而克服了生物量减少对体积生产率的负面影响。乙醇产率在所有ATPase表达菌株中均高于对照菌株。而表达里氏木霉β亚基的菌株5D-atp2在此条件下仍然表现不佳，比生产率和体积生产率均低于对照，与生长偶联实验的结果一致。
四、结论与意义
本研究成功构建了过表达ATP酶基因的酵母菌株，并证明由大肠杆菌F1-ATPase基因表达产生的ATPase活性增加能够显著改善乙醇生产。在生长偶联条件下，乙醇产率显著提高；而在生长解偶联条件下，比生产率、体积生产率和产率均得到明显改善。这为在酿酒酵母中应用强化ATP浪费策略提供了原理验证。此外，研究使用营养缺陷型标记使质粒在酵母细胞中具有稳定性，这也使其对工业应用具有吸引力。该策略可容易地推广到其他与ATP生成偶联的目标代谢产物的生产。
五、研究亮点
本研究的创新之处在于：（1）系统性地比较了不同来源和不同表达方式的ATPase变体在酿酒酵母中的功能活性，发现只有来自大肠杆菌的αβγ三聚体F1-ATPase在游离质粒表达时能产生显著ATPase活性，而基因组整合和单β亚基表达均无效；（2）首次在酿酒酵母中同时考察了生长偶联和生长解偶联（氮饥饿）两种工艺条件下ATP浪费对乙醇生产的影响，证明两阶段发酵工艺可以克服ATP浪费导致的生物量减少问题；（3）利用病毒2A肽序列实现多顺反子表达，减少了构建体大小，且该菌株表现出最优的生产性能；（4）提供了包括生长速率、比速率、体积速率和产率在内的全面生理学数据，填补了此前研究的空白。