本研究的主要作者为Eugenio Mancera，其工作单位是美国加利福尼亚大学旧金山分校微生物与免疫学系及生物化学与生物物理学系。合作者包括布朗大学的Allison M. Porman、麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所的Christina A. Cuomo、布朗大学的Richard J. Bennett以及加利福尼亚大学旧金山分校的Alexander D. Johnson。该研究于2015年5月发表在美国遗传学学会的期刊《G3: Genes, Genomes, Genetics》上（第5卷，第849-856页）。
本研究属于医学真菌学与分子遗传学交叉领域，聚焦于念珠菌属（*Candida*）病原真菌的形态发生（Morphogenesis）调控机制。念珠菌是人类常见的共生微生物，也是免疫功能低下宿主的重要机会性病原体。其适应并侵染人体不同生态位的核心能力，与其一系列形态转变密切相关，这些转变包括：酵母态（yeast form）与菌丝态（filamentous/hyphal form）的转换、生物被膜（Biofilm）的形成，以及白-灰-不透明（white-opaque）等类型遗传性表型转换。其中，转录因子Efg1在白色念珠菌（*C. albicans*）中被发现是调控上述多种形态转变的核心枢纽，它属于真菌特异的APSES家族DNA结合蛋白，在菌丝形成、生物被膜形成以及抑制不透明态转换中起着关键作用。
令人意外的是，在对热带念珠菌（*C. tropicalis*）的基因组测序分析中，并未找到Efg1的直系同源基因（ortholog）。热带念珠菌是与白色念珠菌亲缘关系较近的CTG类群成员，同样具备上述关键的致病相关形态转换能力。这一“基因缺失”现象引发了研究人员的疑问：在热带念珠菌中，Efg1的功能是否已由其旁系同源基因（paralog）Efh1替代？抑或是基因组测序的局限性导致该基因被遗漏？因此，本研究的核心目标就是明确热带念珠菌中是否存在功能性的Efg1直系同源基因，并阐明其在热带念珠菌形态发生中的具体作用。
本研究遵循了从假说验证、基因发现到功能确认的系统性逻辑流程，主要包括三大步骤：
1. 探索旁系同源基因Efh1的功能 首先，为了检验“Efh1替代Efg1功能”的假说，研究人员在热带念珠菌Mya3404菌株背景下，通过SAT1 flipper基因敲除策略构建了*EFH1*基因的纯合缺失突变体（*efh1Δ/efh1Δ*）。他们随后系统地评估了该突变体在三种关键形态转变中的表型： * 菌丝形成：将野生型和突变体菌株接种于含血清的诱导培养基中，在37°C诱导培养，并在2、4、22小时三个时间点通过微分干涉差（DIC）显微镜观察菌丝形成情况。 * 生物被膜形成：在硅片和聚苯乙烯两种基质表面，使用预先用牛血清处理的表面，培养48小时形成生物被膜。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察生物被膜的三维结构，并使用菌群生物量干重法进行定量分析。 * 白-不透明表型转换：通过将细胞稀释后涂布于SPIDER培养基平板，在30°C培养7-10天，观察菌落形态并统计不同表型（白色、中间态、不透明态）的出现频率和转换情况。 实验结果将与野生型菌株进行对比，以判断Efh1是否在其中扮演了Efg1的核心角色。
2. 鉴定并定位热带念珠菌中的EFG1直系同源基因 鉴于Efh1的功能验证结果未能支持其替代假说，研究转向寻找潜在的、被遗漏的*EFG1*基因。此过程结合了分子生物学技巧和测序技术： * PCR扩增与初步确认：首先，使用针对CTG类群中*EFG1*基因保守区域设计的简并引物，以*efh1Δ/efh1Δ*突变体（避免扩增Efh1）的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。通过降低退火温度以提高容错性，成功扩增出一段约260 bp的片段。测序比对显示该片段与白色念珠菌Efg1的相似性高于热带念珠菌Efh1。随后，通过多轮基于已知序列或白色念珠菌同源区域的引物设计，将测序区域延伸至900 bp，但此序列在已公布的热带念珠菌基因组组装序列中无法定位。 * 基因完整序列克隆与基因组定位：为了获得完整基因并确定其基因组位置，研究人员开发了一种巧妙的“捕获”策略。他们构建了一个包含两个选择性标记（在大肠杆菌中筛选的氯霉素抗性基因*camR*和在念珠菌中筛选的诺尔丝菌素抗性基因*sat1*）及一个大肠杆菌复制起始位点的靶向PCR片段。该片段的两侧带有与已测序的*EFG1*部分区域同源的序列。将这一线性化片段通过同源重组整合到热带念珠菌细胞的基因组中，使其插入到内源性*EFG1*位点。随后，从转化子中提取基因组DNA，用限制性内切酶消化并连接使其环化，再转化到大肠杆菌中。通过筛选氯霉素抗性克隆，最终获得了包含完整*EFG1*基因及其上下游序列的质粒，通过测序揭示了完整的开放阅读框（ORF，1701 bp）和基因组位置。 * 序列与进化分析：将获得的序列与数据库进行比对，确认该基因位于热带念珠菌基因组Supercontig 3.1上的一个缺口（gap）区域，正好跨越了该缺口。通过同源性比对（BLAST）、氨基酸序列相似性分析、保守结构域（APSES DNA结合域）鉴定以及系统发育树构建（使用MUSCLE和PhyML软件）等方法，从多个层面证明该基因为白色念珠菌*EFG1*的直系同源基因。
3. 系统验证EFG1基因在热带念珠菌中的功能 获得基因后，最关键的一步是验证其功能。研究人员在Mya3404和另一个遗传背景（AM2005/0093）的菌株中，构建了*EFG1*基因的杂合缺失（*efg1Δ/EFG1*）和纯合缺失（*efg1Δ/efg1Δ*）突变体。 * 菌丝形成表型分析：采用与Efh1突变体相同的血清诱导法，观察*EFG1*缺失突变体在多个时间点的菌丝形成能力。 * 生物被膜形成表型分析：同样在硅片和聚苯乙烯表面，通过共聚焦显微镜观察生物被膜结构，并通过生物量干重法进行定量比较，同时以白色念珠菌*efg1Δ*突变体作为参照。 * 白-不透明表型转换分析：将野生型及*EFG1*杂合、纯合缺失突变体分别从其默认表型状态（野生型为白色，杂合子为中间态，纯合子为不透明态）出发，在SPIDER平板上培养，评估其表型稳定性及相互转换的频率。 所有实验均设置了独立的生物学重复，以确保结果的可靠性。
1. Efh1在热带念珠菌形态发生中作用有限 对*efh1Δ/efh1Δ*突变体的表型分析表明：其在血清诱导的菌丝形成上与野生型无显著差异；在硅片上形成的生物被膜结构与野生型相似，在聚苯乙烯上的生物被膜生物量也无统计学差异；对白-不透明转换频率亦无显著影响。这些结果有力地驳斥了“Efh1替代Efg1功能”的假说，从而将研究焦点转向寻找真正的*EFG1*基因。
2. 成功鉴定出热带念珠菌的EFG1直系同源基因 研究人员成功克隆并测序了热带念珠菌的*EFG1*基因。该基因编码一个由567个氨基酸组成的蛋白质，与白色念珠菌Efg1蛋白的序列一致性达54%，相似性达60%，且APSES DNA结合域几乎完全一致（98%）。系统发育树分析显示该基因明确位于CTG类群的EFG1分支，与Efh1分支截然分开。值得注意的是，该基因在基因组中的位置与白色念珠菌不同，位于同源染色体但不同区域，且其上游调控区异常长（约10 kb），这与白色念珠菌*EFG1*复杂的调控特征相似。
3. Efg1是热带念珠菌形态发生的核心调控因子 功能缺失实验获得了明确且一致的结果： * 菌丝形成：*efg1Δ/efg1Δ*突变体在诱导条件下完全丧失了形成真正菌丝的能力，细胞始终维持在酵母态，而野生型在2小时即可见菌丝突起。这与白色念珠菌中Efg1缺失的表型一致。 * 生物被膜形成：突变体形成的生物被膜严重缺陷，共聚焦显微镜下仅见少量酵母细胞层和假菌丝，缺乏真正的菌丝网络和多层结构；生物量干重显著低于野生型。其表型与白色念珠菌*efg1Δ*突变体高度相似。 * 白-不透明转换：Efg1的缺失彻底改变了表型转换格局。野生型菌株以稳定的白色态为默认状态，转换频率低。而杂合缺失株（*efg1Δ/EFG1*）则以“中间态”（Intermediate state）为默认状态，纯合缺失株（*efg1Δ/efg1Δ*）则以不透明态为默认状态，且两者均仅在中间态和不透明态之间转换，无法稳定维持白色态。这证明热带念珠菌Efg1与白色念珠菌中的功能类似，是维持和促进白色态的关键决定因子。
本研究得出明确结论：热带念珠菌基因组中存在一个功能保守的Efg1直系同源基因，该基因之前因位于基因组装配序列的缺口区域而被遗漏。该基因在热带念珠菌的菌丝形成、生物被膜形成和白-不透明表型转换等关键形态发生过程中扮演着与白色念珠菌Efg1相似的核心调控角色。因此，Efg1作为形态发生主调节因子的功能在念珠菌病原体中具有深远的进化保守性。
本研究的价值体现在科学意义和方法学启示两个方面： * 科学意义：它填补了我们对重要病原真菌热带念珠菌致病机制认知的一个关键空白，明确了Efg1在其致病相关性状中的核心地位，为比较基因组学和念珠菌属病原体进化研究提供了重要案例。这有助于未来开发针对该调控通路的抗真菌策略。 * 方法学启示：本研究是一个生动的警示案例，提醒科研界已发表的基因组序列本质上是“尚待完善的草稿”。研究通过巧妙的实验设计，克服了基因组装配不完整带来的困难，成功“找回”了丢失的基因。这强调了在依赖基因组数据进行推论时，进行实验验证和持续序列校对的极端重要性，尤其是在处理多态性高、组装复杂的基因组时。
研究在讨论部分深入探讨了热带念珠菌基因组组装过程中丢失*EFG1*基因的技术原因。最初使用Arachne软件的标准组装产生了因单倍型合并导致的移码问题。后续为获得更准确的单倍型序列而进行的迭代重新组装，虽然解决了移码，却导致组装完整性下降并产生了新的缺口，*EFG1*基因不幸位于其中一个缺口处。这一剖析使本研究不仅是一项生物学发现，也成为基因组生物信息学分析中一个具有教育意义的实例。